魏 雪 劉淑君 辛鳳姣

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

胸腺素 (又名胸腺肽，thymosin) 是胸腺組織分泌的具有免疫活性的一組多肽，歸屬于α、β、γ三類，共同誘導(dǎo)T細(xì)胞成熟分化，增強(qiáng)T細(xì)胞對抗原的反應(yīng)，從而提高機(jī)體抵抗疾病的能力[1]。其中，胸腺素α、β具有較為明確的臨床應(yīng)用前景。目前臨床上使用的胸腺素主要為胸腺素α1 (Tα1)[2]，其為一種N末端乙?；暮?8個(gè)氨基酸的多肽，通用商品名為胸腺法新 (thymalfasin)。胸腺素在病毒性肝炎、感染性疾病、免疫缺陷性疾病、膿毒血癥和腫瘤等疾病的治療方面均顯示出良好的免疫調(diào)節(jié)效果[3-5]。胸腺素β4 (Tβ4) 的主要生理作用是隔離肌動(dòng)蛋白，進(jìn)而阻止肌動(dòng)蛋白的聚集[6]；Tβ4 也與損傷修復(fù)和受損組織重建密切相關(guān)，可以下調(diào)炎癥趨化因子和細(xì)胞因子，保護(hù)缺血性事件后續(xù)的組織損傷程度[7]。

多肽類化合物的生產(chǎn)，一般可分為固相化學(xué)合成和重組表達(dá)兩種方式[8-11]。雖然固相化學(xué)合成技術(shù)較為成熟，但對于較長的多肽 (15個(gè)氨基酸以上)，其反應(yīng)效率會隨著鏈長增加急劇下降，不僅成本較高，反應(yīng)耗時(shí)也較長；同時(shí)，固相化學(xué)合成中使用大量有毒物質(zhì)，造成較大的環(huán)保壓力[9]。對于 Tα1 而言，目前胸腺法新產(chǎn)品大多采用固相化學(xué)合成方法生產(chǎn)。相比之下，重組表達(dá)更適用于生產(chǎn)較長的多肽，最常見的是酵母和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[10, 12]，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)更簡單高效。使用大腸桿菌體系重組表達(dá)非乙?；?Tα1 前體，可以有效降低生產(chǎn)成本和環(huán)境污染[13]。同時(shí)，前體可經(jīng)體外 N 端乙酰化反應(yīng)，高效生成最終產(chǎn)物。然而，較短多肽在大腸桿菌中直接表達(dá)時(shí)，由于多肽缺乏高級結(jié)構(gòu)，往往會被細(xì)菌蛋白酶降解，不僅極大地降低了表達(dá)量，而且增大了純化難度。融合標(biāo)簽?zāi)軌蛟鰪?qiáng)重組蛋白質(zhì)在宿主體內(nèi)抵抗蛋白質(zhì)水解酶的能力，有效解決短肽降解的問題。有報(bào)道表明，多種融合標(biāo)簽已經(jīng)被成功用于 Tα1 在大腸桿菌中的表達(dá)，如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 (disulfide bond isomerase, DsbA)[14]、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (glutathione S-transferase, GST)[15]、內(nèi)含肽 (intein)[16]等。這些融合蛋白標(biāo)簽雖然極大地提升了表達(dá)量，但由于標(biāo)簽本身分子量很大，是目的多肽的幾倍甚至十幾倍，去除標(biāo)簽后，產(chǎn)出效率較低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。為此，本研究通過篩選多種短肽 (8～18氨基酸) 表達(dá)標(biāo)簽，成功找到了2種能夠高效表達(dá)Tα1和 Tβ4 的A18-KEKE、DKL6K融合標(biāo)簽。這2種融合標(biāo)簽的使用，可使目的多肽在融合序列中占比達(dá)到60%～80%，同時(shí)具有較高的單位表達(dá)量，大大提高胸腺肽類產(chǎn)品重組生產(chǎn)的效率，極大地降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胸腺素及其他多肽融合蛋白基因合成，引物合成和表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建均由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成；大腸桿菌感受態(tài) BL21(DE3)，美國Merck公司；聚丙烯酰胺凝膠，南京金斯瑞公司；高效液相色譜分析柱BEH-C18，美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-Class 超高壓四元液相系統(tǒng)高效液相色譜分析儀、Bioaccord質(zhì)譜分析儀，美國Waters公司；JY-CZ-B蛋白電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；哈希DR3000紫外分光光度計(jì)，美國梅特勒公司；BILON-R500超聲破碎儀，上海比朗儀器有限公司；ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)分析 胸腺素及其他多肽融合蛋白基因堿基合成后通過 NdeI/XhoI 限制性酶切位點(diǎn)插入 pET-11d 載體。所有質(zhì)粒由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒由熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL21(DE3) 中， 37℃過夜培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物以 1∶100 比例接種至 5 mL含有氨芐抗生素(ampicillin，AMP)的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r·min-1下培養(yǎng)至 OD600值為0.8～1.0，加入1 mmol·L-1異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，在37℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)4 h后5 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀，將其懸浮于細(xì)胞裂解液 (20 mmol·L-1Tris pH值8.0, 150 mmol·L-1NaCl) 中，每升菌液用30 mL細(xì)胞裂解液重懸。將懸浮菌液至于冰上，超聲破碎5 s，冷卻5 s，功率為30%，直至菌液澄清透明。分別取菌液60 μL 加入20 μL 的4×上樣緩沖液，沸水煮10 min，上樣 8 μL，用10%濃度SDS-PAGE 電泳分析，鑒定重組蛋白的表達(dá)。

1.3.2 超高效液相色譜分析 各種不同表達(dá)載體的單位表達(dá)量通過反相超高效液相色譜法測定, 色譜柱為美國Waters公司ACQUITY UPLC PROTEIN BEH 2.1 mm×100 mm C4反相色譜柱，粒徑 1.7 μm，色譜系統(tǒng)為H-Class超高效液相色譜儀(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，流動(dòng)相為含有 1% 三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)的水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度為 20%～60% B 相，洗脫時(shí)間為5 min。樣品為不同表達(dá)載體的細(xì)胞裂解液，按表達(dá)結(jié)束后培養(yǎng)基 600 nm波長處光吸收值，稀釋到10 OD600·L-1，而后經(jīng)8 mol·L-1尿素溶液5倍稀釋后(最終尿素濃度約6 mol·L-1)， 以相同進(jìn)樣量使用反相液相色譜法定量。各樣品主峰經(jīng)積分后，根據(jù)多肽標(biāo)準(zhǔn)品峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線換算可得樣品目的蛋白濃度。

1.3.3 質(zhì)譜分析 利用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用 (liquid chromatograph-mass spectrometer，LC/MS) 法對不同表達(dá)載體表達(dá)的目的蛋白的完整分子量進(jìn)行鑒定， LC/MS法中色譜為反相液相色譜，所用色譜條件與高效液相色譜分析中類似，僅降低流動(dòng)相中的TFA濃度至 0.04% 以保證質(zhì)譜離子化效果。取得質(zhì)核比數(shù)據(jù)后，經(jīng)解卷積運(yùn)算后得到單同位素分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 胸腺素α1和β4促表達(dá)融合標(biāo)簽的篩選

為了促進(jìn)胸腺素α1和β4在大腸桿菌中的表達(dá)，將融合標(biāo)簽分別連接于胸腺素α1和β4的N端，并用酶切位點(diǎn)進(jìn)行分隔，進(jìn)行融合表達(dá)(圖1)。表1列舉了融合標(biāo)簽的序列信息，分子量范圍為878.53～13 661.74 Da，等電點(diǎn) (isoelectric point，pI) 從5.55到9.18。酶切位點(diǎn)選取的牛腸激酶酶切位點(diǎn)，氨基酸序列為DDDDK，在制備過程中可用于切掉融合標(biāo)簽，獲得野生型胸腺素α1和β4。

由表2和表3可知融合蛋白的全序列。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3) 菌株，并于37℃ 下培養(yǎng)，通過IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 h 后，進(jìn)行菌體收集。收集后的菌體進(jìn)行超聲后，采用 SDS-PAGE 電泳觀察全菌種融合蛋白的表達(dá)量。

圖1 融合蛋白表達(dá)結(jié)構(gòu)圖

表1 促表達(dá)所用標(biāo)簽信息

表2 胸腺素 α1 融合蛋白信息

由圖2和圖3可知，無融合標(biāo)簽的胸腺素α1和β4在大腸桿菌 BL21(DE3) 表達(dá)菌株中未表達(dá)；在篩選的8種融合標(biāo)簽中，有4種可以使胸腺素α1有效表達(dá)，分別是A18-KEKE、DKL6K、A8-GFIL和SUMO；有3種融合標(biāo)簽可以使胸腺素β4有效表達(dá)，分別是A18-KEKE、DKL6K和SUMO?？梢夾18-KEKE、DKL6K和SUMO同時(shí)適用于2種胸腺素的表達(dá)。

2.2 融合標(biāo)簽應(yīng)用于其他胸腺素家族蛋白的表達(dá)

由于SUMO分子量較大 (13 661.74 Da)，在整個(gè)融合蛋白的占比較大。融合標(biāo)簽A18-KEKE和DKL6K的分子量較小，因此選取這2種融合標(biāo)簽與胸腺素家族蛋白 (胸腺素β4、胸腺素β4Y、胸腺素β10和胸腺素β15) 進(jìn)行融合表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。A18-KEKE和DKL6K融合標(biāo)簽可以有效地促進(jìn)胸腺素β4Y、胸腺素β10和胸腺素β15在大腸桿菌中的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證融合蛋白在大腸桿菌的表達(dá)形式，利用超聲波破碎細(xì)胞壁，離心后通過 SDS-PAGE 電泳分析。由圖5可知，A18-KEKE-胸腺素家族融合蛋白均表達(dá)在上清中，說明均為可溶性表達(dá)，這樣更有利于下游的蛋白制備，從而避免形成不可溶性包涵體。

表3 胸腺素β4融合蛋白信息

注：1：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2：無融合標(biāo)簽的胸腺素α1；3：A16-LELK融合胸腺素α1；4：A18-KEKE融合胸腺素α1；5： A18-EKEK融合胸腺素α1；6：DKL6K融合胸腺素α1；7：A8-GFIL融合胸腺素α1；8：A12-FKFE融合胸腺素α1；9：Insu.B融合胸腺素α1；10：SUMO融合胸腺素α1； 箭頭表示重組蛋白位置。

2.3 融合蛋白的表達(dá)鑒定

利用LC/MS對不同表達(dá)載體所表達(dá)融合蛋白的完整分子量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示(圖6)，所有被測樣品的單同位素分子量均與理論值差值在1 Da 以內(nèi)，表明過表達(dá)條帶含有目的多肽。

2.4 融合蛋白表達(dá)量定量分析

利用反相超高效液相色譜法對不同表達(dá)載體的單位表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示 (圖7-A)，幾種目的蛋白均在洗脫梯度內(nèi)表征為明顯主峰。根據(jù)多肽標(biāo)準(zhǔn)品峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，積分換算后可得每種樣品中的目的融合多肽的單位表達(dá)量 (mg·OD-1·L-1)。結(jié)果顯示(圖7-B)，帶有融合標(biāo)簽A18-KEKE的胸腺素表達(dá)載體，可在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，單位表達(dá)量在73～123 mg·OD-1·L-1之間。

2.5 融合標(biāo)簽應(yīng)用于其他常見治療性多肽的表達(dá)

為了進(jìn)一步拓展 A18-KEKE 和 DKL6K 對多肽類蛋白在體外表達(dá)的適用性，將這2種融合標(biāo)簽融合于促進(jìn)胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide 1，GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2 (glucagon like peptide 2，GLP-2)、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH 1-34) 和糖依賴性胰樣多肽 (glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP) (表4)。由圖8可知，這2種融合標(biāo)簽可以有效地促進(jìn)GLP-1、GLP-2、PTH 1-34和GIP，證實(shí)了這2種融合標(biāo)簽的廣譜適用性。

注：1：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2：A18-KEKE-胸腺素α1表達(dá)菌體裂解液上清液；3：A18-KEKE-胸腺素α1表達(dá)菌體裂解液沉淀；4：A18-KEKE-胸腺素β4表達(dá)菌體裂解液上清液；5：A18-KEKE-胸腺素β4表達(dá)菌體裂解液沉淀；6：A18-KEKE-胸腺素β4Y表達(dá)菌體裂解液上清液；7：A18-KEKE-胸腺素β4Y表達(dá)菌體裂解液沉淀；8：A18-KEKE-胸腺素β10表達(dá)菌體裂解液上清液；9：A18-KEKE-胸腺素β10表達(dá)菌體裂解液沉淀；10：A18-KEKE-胸腺素β15表達(dá)菌體裂解液上清液；11：A18- KEKE-胸腺素β15表達(dá)菌體裂解液沉淀；箭頭表示重組蛋白位置。

3 討論

在胸腺素家族中，關(guān)于Tα1 的研究最為深入。Tα1 最早從牛胸腺組織提取的胸腺素組份5 (TF5) 中分離鑒定出來[5]，是一種N端乙?；暮?8個(gè)氨基酸的可溶性多肽。其主要功能是促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟和分化，并促使成熟的T細(xì)胞分泌白介素-2，γ-干擾素等多種淋巴因子，同時(shí)促進(jìn)白介素-2受體的生成[17]；另外，Tα1 還可直接抑制或殺傷某些病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[18]。因此，Tα1 已被廣泛應(yīng)用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷癥的預(yù)防和治療，如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞性肺癌[17]、冠狀病毒引起的 SARS 和 2019新冠肺炎等[19-20]。目前，國內(nèi)外已有多家制藥企業(yè)的 Tα1 產(chǎn)品上市，年銷售額30億人民幣以上，市場十分廣闊。Tβ4是胸腺素家族中另一有廣泛臨床應(yīng)用潛力的成員，其主要功能為調(diào)節(jié)人體內(nèi)肌動(dòng)蛋白，在組織再生、重塑、創(chuàng)傷愈合、腫瘤發(fā)病與轉(zhuǎn)移、炎癥、毛囊發(fā)育等生理、病理過程中起重要作用[21-22]。目前，已有制藥企業(yè)展開 Tβ4 在心肌埂塞等疾病領(lǐng)域的臨床試驗(yàn)[23-24]。

注：A～E分別表示胸腺素α1, β4, β4Y, β10, β15與表達(dá)標(biāo)簽A18-KEKE融合蛋白完整分子量鑒定，顯示結(jié)果為質(zhì)譜的質(zhì)核比 圖；F：融合蛋白理論和表觀分子量比較。

注：A為典型色譜圖；B為隨機(jī)選取3個(gè)克隆，表達(dá)后經(jīng)高效液相色譜分析，主峰峰面積積分后，參照標(biāo)準(zhǔn)品峰面積換算，計(jì)算單位表達(dá)量。

近年來，隨著體外N端乙酰化修飾技術(shù)的成熟, 利用基因工程技術(shù)制備重組 Tα1 成為替代化學(xué)合成的趨勢，重組Tα1也已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段[11]。目前體外制備多采用多串體(2～8個(gè))基因不溶性包涵體表達(dá)[25]和單體基因細(xì)胞間質(zhì)分泌表達(dá)[12]兩種方式，雖取得一定成功，但缺點(diǎn)明顯。多串體基因表達(dá)產(chǎn)生包涵體，需經(jīng)變性溶解、復(fù)性、酶解等一系列復(fù)雜工藝，生產(chǎn)活性單體；而單體基因分泌表達(dá)，受細(xì)胞間質(zhì)空間限制，表達(dá)量一般較低，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，開發(fā)一種表達(dá)量高且后續(xù)工藝簡單易行的 Tα1重組表達(dá)方法是一個(gè)亟待解決的問題。

表4 標(biāo)簽A18-KEKE 及DKL6K融合蛋白信息

注：1：A18-KEKE-GLP-1 (9-37, 34R) 融合蛋白表達(dá)；2：A18- KEKE-GLP-1 (7-37, 34R) 融合蛋白表達(dá)；3：A18- KEKE GLP-2 (1-33) 融合蛋白表達(dá)；4：A18- KEKE-GIP融合蛋白表達(dá)；5：A18- KEKE PTH (1-34)融合蛋白表達(dá)；6：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；7：DKL6K-GLP-1 (9-37, 34R)融合蛋白表達(dá)；8：DKL6K-GLP-1 (7-37, 34R)融合蛋白表達(dá)；9：DKL6K-GLP-2 (1-33)融合蛋白表達(dá)；10：DKL6K-GIP融合蛋白表達(dá)； 11：DKL6K-PTH (1-34)融合蛋白表達(dá)；箭頭表示重組蛋白位置。

大腸桿菌平臺已被廣泛應(yīng)用于多肽產(chǎn)品的生產(chǎn)，長度較短的(小于100個(gè)氨基酸)多肽在重組表達(dá)過程中易被蛋白酶降解，且在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)，宿主菌會調(diào)動(dòng)各種機(jī)制來阻止其過量表達(dá)，導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)量降低，因此可通過添加融合標(biāo)簽應(yīng)用于短肽的生產(chǎn)。常用的融合標(biāo)簽有：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)、硫氧還蛋白 (Trx)、SUMO蛋白酶 (SUMO)、泛素 (ubiquitin) 等[26-28]，然而這些標(biāo)簽蛋白分子量較大 (10～40 kDa)，在蛋白質(zhì)過表達(dá)過程中會消耗更多代謝能量，因此造成如 Tα1 較短目的多肽在融合蛋白中所占比例較低 (20%以下)，嚴(yán)重影響最終得率。近年來，很多兩親性 β 折疊、α 螺旋短肽及類表面活性劑短肽融合標(biāo)簽被成功應(yīng)用于多種生物活性多肽重組表達(dá)，但融合蛋白均以不溶性的包涵體形式存在，需經(jīng)變性溶解-復(fù)性等過程產(chǎn)生活性單體多肽分子，工藝相對復(fù)雜。且在復(fù)性過程中，蛋白往往產(chǎn)生多種異構(gòu)體，不利于目的多肽的純化。

本研究首次成功設(shè)計(jì)并篩選到了 2 種標(biāo)簽 (A18-KEKE和DKL6K)，有效促進(jìn)了Tα1 和 Tβ4 等胸腺素多肽的表達(dá)，且均為可溶性表達(dá)。后續(xù)可以利用離子交換，凝膠過濾層析等方法進(jìn)行蛋白分離純化，有效簡化重組表達(dá)后純化操作，為胸腺素家族多肽蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究篩選到的2種融合標(biāo)簽可能幫助多肽正確折疊進(jìn)而促進(jìn)其可溶性表達(dá)，但具體機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。通過超高效反相液相色譜對單位表達(dá)量進(jìn)行測定，預(yù)期在高密度發(fā)酵中，目的多肽產(chǎn)量有望達(dá)到3 g·L-1培養(yǎng)液以上，應(yīng)用潛力巨大。同時(shí)，這2種融合標(biāo)簽亦可有效促進(jìn)人高血糖素樣肽 (GLP-1, GLP-2)、人甲狀旁腺素PTH (1-34)、糖依賴性胰樣多肽 (GIP) 等多肽在大腸桿菌中的表達(dá)，具有一定的普適性。本研究對其中結(jié)構(gòu)與組成較為復(fù)雜的甲狀旁腺激素 (PTH 1-34) 進(jìn)行了純化和體外細(xì)胞活性測定，以檢測所用標(biāo)簽及表達(dá)體系對蛋白的活性的影響情況，結(jié)果顯示，純化得到的PTH 1-34具有較好的細(xì)胞活性。而對于結(jié)構(gòu)簡單、不含有二硫鍵、不需要糖基化的胸腺素多肽，通過該系統(tǒng)表達(dá)、純化得到了純度較高、性質(zhì)均一的目的蛋白，后續(xù)將進(jìn)一步建立其活性測定方法，進(jìn)行深入研究。本研究篩選出了2種短肽融合標(biāo)簽，能夠有效提高多肽的表達(dá)產(chǎn)量，為拓寬多肽類藥物的生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論參考。

4 結(jié)論

本研究篩選到了2種胸腺素家族多肽在大腸桿菌中重組表達(dá)的融合標(biāo)簽(A18-KEKE和DKL6K)。2種融合標(biāo)簽與胸腺肽所形成的融合蛋白，在被試驗(yàn)的條件下均以可溶性蛋白形式表達(dá)，易于分離純化，且單位表達(dá)量較高。2種融合標(biāo)簽也被證實(shí)可用于人高血糖素樣肽等多肽在大腸桿菌中的過表達(dá)，具備一定的普適性。本研究為胸腺素家族多肽的大量生產(chǎn)應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。