童靜燕 張建斌 秦宇芬

1 蘭溪市婦幼保健院 浙江 蘭溪 321100

2 湖州市中醫(yī)院 浙江 湖州 313000

冠心病是臨床上較為常見的疾病，發(fā)病率較高，急性心肌梗死是其主要并發(fā)癥之一，具有發(fā)病急驟、病情嚴(yán)重、致死率高等特點(diǎn)。目前，臨床上的治療方式以溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)、抗凝等為主，可恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血運(yùn)，減少心肌梗死面積，恢復(fù)心臟結(jié)構(gòu)與功能，但在恢復(fù)血運(yùn)的同時(shí)，再灌注可損傷心肌組織，破壞心臟結(jié)構(gòu)與功能，且現(xiàn)有方法無法有效避免[1]。心肌缺血再灌注損傷(MIRI)由多種因素引起，包括氧自由基(OFR)增多、Ca2+超載、炎癥因子等有關(guān)[2]，治療過程中往往具有兩面性，如使用抗氧化劑治療，會(huì)對(duì)心肌組織造成損傷，因此，如何有效預(yù)防治療MIRI已成為臨床研究的重點(diǎn)。

活絡(luò)效靈丹（當(dāng)歸、丹參、乳香、沒藥）源于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由名醫(yī)張錫純先生所著，組方簡(jiǎn)練，可通絡(luò)止痛、祛瘀生新[3]?；罱j(luò)效靈丹在祛瘀、治療內(nèi)外創(chuàng)傷、改善關(guān)節(jié)炎癥、疼痛及糖尿病并發(fā)癥等方面療效較佳；且其具有多種藥理活性成分包括阿魏酸、香草酸、丹參酮、丹酚酸、原兒茶醛、黃酮及其糖苷、三萜和三萜皂苷等[4]。本研究采用活絡(luò)效靈丹預(yù)處理MIRI模型大鼠，旨在探討活絡(luò)效靈丹對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎所致大鼠急性心肌缺血再灌注的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性SD大鼠，200～230g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016；處于溫度23～25℃，濕度55%～70%的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1w，期間均采用標(biāo)準(zhǔn)食物飼養(yǎng)，允許自由飲水。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：活絡(luò)效靈丹購(gòu)于北京同仁堂(組方：當(dāng)歸、丹參、生沒藥、生乳香各15g)；肌酸激酶同工酶-MB(CK-MB，IC-CKMB-Hu)、乳酸脫氫酶(LDH，ICLDH-Hu)、髓過氧化物酶(MPO，IC-MPO-p)、超氧化物歧化酶(SOD，IC-SOD-Ra)、丙二醛(MDA，IC-MDA-Ge)、白細(xì)胞介素-10(IL-10，IC-IL10-p)試劑盒購(gòu)于IC/IBL；腫瘤壞死因子-α(TNF-α，MM-0180R2)、IL-1β、IL-6(MM-0047R2、MM-0190R2)試劑盒購(gòu)于酶免。Micro17R低溫高速離心機(jī)(Thermo)；PL3504生物信號(hào)采集系統(tǒng)(ADI)；AE2000顯微鏡(Motic)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與MIRI模型制備：1w喂養(yǎng)完畢后，SD大鼠隨機(jī)分為活絡(luò)效靈丹低、高劑量組(2.7、5.4g/kg·d-1活絡(luò)效靈丹)、假手術(shù)組、模型組(等體積生理鹽水)，各10只，均腹腔注射給藥7d，末次給藥30min后制備MIRI模型。

麻醉大鼠，固定，鈍性分離并暴露氣管，切開后給予機(jī)械通氣，設(shè)置相關(guān)參數(shù)。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈于氣管插管后，于動(dòng)脈處放置生物信號(hào)采集系統(tǒng)等相關(guān)內(nèi)置管，收集信息。切開左胸暴露心臟，剝脫心包，采用小型乙烯基管通過距左心耳2mm處，隨后平衡15min，完畢對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行套圈并結(jié)扎。結(jié)扎左前降支（LAD）誘導(dǎo)心肌缺血，30min后再灌注120min。假手術(shù)組不結(jié)扎LAD僅套圈，其余組均進(jìn)行上述操作。心電圖（EKG）觀察，當(dāng)?shù)湫吞Ц叩腟T段下降＞1/2時(shí)，即MIRI模型制備成功。頸主動(dòng)脈采血，離心收集上清液，－20℃冷凍保存。立即處死各組大鼠，打開胸腔并取出心臟，分離缺血梗死區(qū)域，置于液氮冷凍做進(jìn)一步分析。

1.4 心臟功能參數(shù)的測(cè)定：模型制備完畢穩(wěn)定數(shù)分鐘后，依據(jù)采集系統(tǒng)自我分析的數(shù)據(jù)，記錄射血分?jǐn)?shù)（EF）、左心室縮短分?jǐn)?shù)（FS）、左室舒張壓（LVDP）等相關(guān)心功能參數(shù)。

1.5 心肌梗死面積測(cè)定：取各組大鼠左心室稱重切片5段（1～2mm厚），37℃避光置1%TTC溶液中孵育15 min，染色完畢后進(jìn)行固定，隨后拍照。軟件計(jì)算紅色非梗死區(qū)和白色梗死區(qū)面積，并計(jì)算心肌梗死面積。

1.6 HE染色：心肌切片，約4μm，固定，隨后清洗，蘇木素染色0.5s，將浮色洗去，1%鹽酸酒精進(jìn)行分化1～3s，弱氨水浸潤(rùn)心肌切片5～10s，利用0.5%伊紅溶液復(fù)染30～60s，隨后再利用梯度乙醇依次沖洗切片2s，封片后顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.7 血清心肌酶活性測(cè)定：全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)離心并收集各組大鼠頸主動(dòng)脈血的上清液中的CK-MB、LDH活性。

1.8 心肌組織中MPO、SOD活性、MDA含量及炎性因子水平的測(cè)定：參照相關(guān)試劑盒說明，測(cè)定心肌組織中MPO、SOD活性、MDA水平；同時(shí)采用ELISA法對(duì)IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平進(jìn)行測(cè)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 16.00分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，兩組間比較采用Student t test。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活絡(luò)效靈丹對(duì)心臟功能的影響：對(duì)各組大鼠再灌注120min后的心臟功能指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行記錄。由圖1可知，與假手術(shù)組比較，模型組LVDP、EF、FS水平均顯著性降低(P＜0.01)；與模型組比較，活絡(luò)效靈丹高劑量組LVDP、EF、FS水平均顯著性升高(P＜0.01)，活絡(luò)效靈丹低劑量組除EF水平無顯著性差異(P＞0.05)外，LVDP、FS水平均顯著性升高(P＜0.05，P＜0.01)。

圖1 心臟功能參數(shù)的比較

2.2 活絡(luò)效靈丹對(duì)心肌梗死面積的影響：采用TTC染色法測(cè)定心梗面積，由圖2可知，假手術(shù)組心肌未見梗死，而模型組可見大片心肌切片呈白色，即梗死區(qū)較假手術(shù)組明顯增多。與模型組比較，活絡(luò)效靈丹處理可顯著減少大鼠心肌梗死面積，且呈劑量依賴性。

圖2 TTC染色下心肌梗死面積的比較

2.3 活絡(luò)效靈丹對(duì)心肌組織病理的影響：采用HE染色分析心肌組織病理變化，由圖3可知，與假手術(shù)組比較，模型組具有紊亂、破裂溶解的心肌結(jié)構(gòu)，且炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，呈局部變性壞死，間質(zhì)水腫充血?；罱j(luò)效靈丹處理干預(yù)后，可見較整齊的心肌纖維排列，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減少，且間質(zhì)腫脹程度減輕，其中活絡(luò)效靈丹高劑量組心肌損傷改善顯著。

圖3 HE染色下心肌組織病理改變的比較

2.4 活絡(luò)效靈丹對(duì)血清心肌酶活性的影響：全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清CK-MB、LDH活性，由圖4可知，與假手術(shù)組比較，模型組CK-MB、LDH表達(dá)活性均顯著性上升(P＜0.01)；與模型組比較，活絡(luò)效靈丹高劑量組CK-MB、LDH表達(dá)活性均顯著性降低(P＜0.01)，活絡(luò)效靈丹低劑量組LDH表達(dá)活性顯著性降低(P＜0.05)，而CK-MB表達(dá)活性水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖4 活絡(luò)效靈丹對(duì)血清心肌酶活性的影響

2.5 活絡(luò)效靈丹對(duì)心肌組織MPO、SOD、MDA水平的影響：由圖5可知，與假手術(shù)組比較，模型組顯著上調(diào)MPO、MDA水平(P＜0.01)，SOD水平降低(P＜0.05)；與模型組比較，活絡(luò)效靈丹低劑量組顯著下調(diào)MDA含量水平(P＜0.05)，而MPO、SOD活性水平無顯著性差異(P＞0.05)；活絡(luò)效靈丹高劑量組顯著下調(diào)MPO、MDA水平(P＜0.01)，升高SOD水平(P＜0.05)。

圖5 各組心肌組織MPO、MDA、SOD水平的比較

2.6 活絡(luò)效靈丹對(duì)心肌組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平的影響：ELISA法測(cè)定IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平，由圖6可知，與假手術(shù)組比較，模型組顯著上調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α水平(P＜0.01)，而IL-10水平顯著性降低(P＜0.01)；與模型組比較，活絡(luò)效靈丹高劑量組顯著下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α水平(P＜0.05或P＜0.01)，IL-10水平顯著性升高(P＜0.01)，活絡(luò)效靈丹低劑量組顯著下調(diào)IL-1β、IL-6水平(P＜0.05)，而IL-10、TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖6 各組心肌組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

3 討論

MIRI屬“胸痹心痛”“心悸”等范疇，多與素體陽虛、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等相關(guān)，胸陽不展、心陰內(nèi)耗，恣肥喜甘日久傷脾、釀濕生痰，或憂思傷脾，郁怒傷肝等，均可致氣滯、心脈痹阻。故而應(yīng)以舒經(jīng)活絡(luò)、活血祛瘀生新為其治療之根本?；罱j(luò)效靈丹方中當(dāng)歸可活血補(bǔ)血，養(yǎng)肝通心脈；丹參除煩養(yǎng)心，可破宿血生新，配以當(dāng)歸，一可使氣血各有所歸，二可擴(kuò)大活血祛瘀生新之效；乳香、沒藥活血生肌，定痛散瘀，且皆為活血止痛藥，二者配伍，可流通經(jīng)絡(luò)而宣通臟腑，進(jìn)一步擴(kuò)大消腫生肌、活血止痛之功。調(diào)和四藥，共奏排毒生肌、養(yǎng)血活血、舒經(jīng)活絡(luò)、祛瘀生新之效。切合MIRI病因病機(jī)，恰為對(duì)癥之方。又兼藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸有諸多活性成分，其中酚類化合物阿魏酸具有抗氧化應(yīng)激、清除自由基及降血脂等作用，且其鈉鹽可通過抑制血栓素A2（TXA2）、MDA生成，從而起到防止血栓作用；當(dāng)歸還可通過再生海馬神經(jīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)起到抗抑郁作用[5]；丹參活性成分對(duì)血管有擴(kuò)張作用，改善缺血心肌的血液循環(huán)，減輕心肌損傷等作用[6]。

綜上，采用活絡(luò)效靈丹預(yù)處理對(duì)于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起的MIRI具有顯著的保護(hù)作用，可能與改善心臟結(jié)構(gòu)功能、縮小心肌梗死面積、抑制血清心肌酶CK-MB、LDH活性、抗OFR損傷、抗脂質(zhì)過氧化、維持Ca2+平衡、調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子表達(dá)來抑制炎癥反應(yīng)等有關(guān)。