鞏會杰，唐建榮，姚蘭杰，馮鵬飛

青蒿琥酯通過miR-21/PTEN通路對人大腸癌CCL229細胞惡性生物學行為抑制作用的研究

鞏會杰，唐建榮，姚蘭杰，馮鵬飛

駐馬店市中心醫(yī)院 消化內科，河南 駐馬店 463000

探究青蒿琥酯對人大腸癌CCL229細胞惡性生物學行為抑制作用的機制。采用MTT法檢測青蒿琥酯對CCL229細胞活力的影響；通過流式細胞術檢測青蒿琥酯對CCL229細胞凋亡的影響；采用Transwell法檢測青蒿琥酯對CCL229細胞侵襲能力的影響；采用克隆形成實驗檢測青蒿琥酯對CCL229細胞集落形成能力的影響；采用Western blotting法檢測青蒿琥酯對CCL229細胞內自噬特異性蛋白如自噬效應蛋白（Beclin1）、輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ蛋白（light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ）、自噬相關蛋白5（autophagy related protein 5，Atg5）、Atg5-Atg12復合物以及上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白如緊密連接蛋白（ZO-1）、上皮鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin）、神經鈣黏蛋白（neuronal cadherin，N-cadherin）、鋅指轉錄因子（Slug）和第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）表達的影響；采用qRT-PCR法檢測青蒿琥酯對CCL229細胞內mRNA表達的影響；通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證與的靶向關系；考察過表達或抑制與對青蒿琥酯抑制CCL229細胞惡行生物學行為的影響。青蒿琥酯顯著降低CCL229細胞存活率（＜0.05、0.01、0.001），顯著促進CCL229細胞凋亡（＜0.001），顯著抑制CCL229細胞侵襲和克隆形成能力（＜0.001），顯著上調CCL229細胞內Atg5-Atg12復合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、ZO-1、E-cadherin表達水平（＜0.05、0.01），顯著下調N-cadherin和Slug蛋白表達水平（＜0.05）。CCL229細胞內mRNA高表達（＜0.01），青蒿琥酯顯著抑制CCL229細胞內mRNA表達水平（＜0.05）。過表達顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞的促凋亡作用（＜0.001），顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞侵襲和克隆形成能力的抑制作用（＜0.01），顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞Atg5-Atg12復合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、ZO-1、E-cadherin表達水平的上調作用（＜0.05、0.01），顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞N-cadherin和Slug蛋白表達水平的下調作用（＜0.01）；抑制則作用相反。是的下游靶基因，過表達顯著抑制CCL229細胞內PTEN蛋白表達水平（＜0.01），抑制顯著上調PTEN蛋白表達水平（＜0.01），過表達顯著抑制野生型PTEN（）質粒的熒光素酶活性（＜0.01）。過表達與抑制表達對CCL229細胞作用一致，同時過表達和不會影響青蒿琥酯對CCL229細胞惡性生物學行為的抑制作用。青蒿琥酯能夠通過調控miR-21和PTEN表達誘導CCL229細胞凋亡和自噬，并抑制細胞增殖和侵襲。

大腸癌；青蒿琥酯；miRNA；增殖；侵襲；上皮間質轉化；自噬；凋亡

大腸癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。目前手術、化療和放療是治療大腸癌的主要手段[2]。5-氟尿嘧啶是用于治療實體瘤的主要藥物，臨床廣泛應用于大腸癌的治療，治療效果較好[3]，然而化療對患者帶來的不良反應不容小覷，因此尋找有效且不良反應較小的藥物對提升大腸癌患者的治療效果至關重要。

微小RNA（miRNA，miR）是一類在真核生物中起轉錄后調控作用的非編碼小分子RNA，在細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學行為中起重要作用[4]。研究表明，miRNA在腫瘤中的異常表達可作為抑癌基因參與大腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、轉移、侵襲等過程，且與患者的預后密切相關[5-6]。miR-21在大腸癌患者血清中異常高表達[7]，且參與大腸癌細胞的增殖、凋亡、侵襲等過程[8]。青蒿琥酯是從傳統(tǒng)中藥青蒿中提取出的一種天然倍半萜烯，是治療瘧疾的安全藥物[9]。Efferth等[10]發(fā)現青蒿琥酯能誘導腫瘤細胞凋亡，對多發(fā)性骨髓瘤[11]、宮頸癌[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]等多種腫瘤具有抑制作用，但其抗腫瘤的作用機制尚不清楚。本研究探究青蒿琥酯抑制大腸癌細胞惡性生物學行為的作用機制，為其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 細胞

人大腸癌CCL229細胞株和人正常腸上皮HIEC細胞株購自上?？道噬锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 藥品與試劑

青蒿琥酯（60 mg/支）購自桂林南藥股份有限公司；5-氟尿嘧啶（0.25 g/支）購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；胎牛血清（批號SA190501）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號C22400500BT）、DMEM培養(yǎng)基（批號C11995500CP）、Trizol試劑（批號15596-026）、PrimeScript逆轉錄試劑盒（批號RR047A）、SYBR Green Real-Time PCR MasterMix試劑盒（批號RR420A）、Lipofectamine 2000試劑盒（批號11668-027）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RAPI蛋白裂解液（批號P0013）、BCA試劑盒（批號P0010S）購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒（批號GM01-500T）、Annexin V-FITC/PI試劑盒（批號40302ES20）購自上海翊圣生物科技有限公司；Dual-Luciferase Reporter Assay Kit試劑盒（批號ab228530）購自美國Promega公司；Transwell小室（批號353090）購自美國Corning公司；緊密連接蛋白（ZO-1）抗體（批號13663）、上皮鈣黏蛋白（epithelial cadheri，E-cadherin）抗體（批號3195）、神經鈣黏蛋白（neuronal cadherin，N-cadherin）抗體（批號61572S）、鋅指轉錄因子（Slug）抗體（批號9585）、第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）抗體（批號9188）、自噬相關蛋白5（autophagy related protein 5，Atg5）抗體（批號9980）、Atg12抗體（批號4180）、自噬效應蛋白（Beclin 1）抗體（批號3495）、輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ蛋白（light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ）兔抗人單克隆抗體（批號4599）購自美國CST公司；β-肌動蛋白（β-actin）鼠抗人單克隆抗體（批號20536-1-AP）、HRP標記的IgG抗體購自美國Protein Tech Group公司；引物由山東維真生物科技有限公司設計并合成。

1.3 儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設備一廠）；恒溫培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司）；低溫高速離心機（德國Heraeus公司）；倒置顯微鏡和光學顯微鏡（日本Olympus公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀器（華東電子集團醫(yī)療裝備有限公司）；PCR擴增儀（美國ABI公司）；流式細胞儀（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

CCL229細胞和HIEC細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 青蒿琥酯對CCL229細胞存活率的影響

取處于對數生長期的CCL229細胞，以2×104/孔接種于96孔板中，100 μL/孔，設置對照組、青蒿琥酯（5、10、20、40 μg/mL）組和5-氟尿嘧啶（40 μg/mL）組，待細胞貼壁后，各給藥組加入100 μL相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，采用酶標儀檢測490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

2.3 青蒿琥酯對CCL229細胞凋亡的影響

取處于對數生長期的CCL229細胞，以1×105/mL接種于6孔板中，2 mL/孔，設置對照組、青蒿琥酯（20 μg/mL）組和5-氟尿嘧啶（40 μg/mL）組，待細胞貼壁后，各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集細胞，1000×離心5 min后棄上清，PBS沖洗3次后重懸細胞，加入1 mL 70%預冷乙醇溶液固定細胞；加入PBS離心沉淀去除固定液，加入100 μL RNA消化酶（100 μg/mL），37 ℃水浴30 min，加入100 μL碘化丙啶（PI，50 μg/mL）染色液，4 ℃避光染色30 min后，采用流式細胞儀進行檢測。

2.4 青蒿琥酯對CCL229細胞侵襲能力的影響

將Matrigel和無血清RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶1配制成細胞外基質膠，Transwell小室中加入30 μL細胞外基質膠。按“2.3”項下方法處理細胞，收集細胞，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，在Transwell小室的上室中加入200 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。擦除小室濾膜內表面細胞，于4%多聚甲醛中固定，PBS沖洗3次后使用0.1%結晶紫染色，于顯微鏡下對穿過膜的細胞進行計數。

2.5 青蒿琥酯對CCL229細胞克隆形成的影響

按“2.3”項下方法處理細胞，收集細胞，臺盼藍染色后對活細胞進行計數。將細胞接種于6孔板，加入3 mL含FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，隔天更換培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后對各組集落數目進行計數。

2.6 青蒿琥酯對CCL229細胞自噬特異性蛋白及上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白表達的影響

按“2.3”項下方法處理細胞，收集細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質量濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，于室溫封閉1 h，分別加入Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5、Atg12、ZO-1、E-cadherin、N-cadherin、Slug、β-actin抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加入HRP標記的IgG抗體（1∶10 000），于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后使用ECL發(fā)光試劑盒顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.7 CCL229細胞和HIEC細胞中miR-21 mRNA表達

設置CCL229組、HIEC組和青蒿琥酯（20 μg/mL）組，HIEC組加入HIEC細胞，其余各組加入CCL299細胞，以1×105/mL接種于6孔板中，待細胞貼壁后，青蒿琥酯組加入藥物，培養(yǎng)24 h。收集細胞，按照試劑盒說明書提取RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAG- ACTGA-3’，下游引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.8 過表達或抑制miR-21對CCL229細胞miR-21 mRNA表達的影響

設置對照組、過表達陰性對照組（miR-NC mimics）、過表達組（miR mimics）、抑制陰性對照組（miR-NC inhibitor）、抑制組（miR inhibitor）。按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書將、（）、、（）轉染至CCL229細胞內，48 h后，按“2.7”項下方法檢測CCL229細胞中mRNA表達情況。序列：5’-UA- GCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；序列：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。

2.9 過表達或抑制miR-21對青蒿琥酯促CCL229細胞凋亡的影響

設置對照組、過表達組（miR mimics）、抑制組（miR inhibitor）。按“2.8”項下方法進行轉染，轉染48 h后，各組加入青蒿琥酯（20 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下方法檢測細胞凋亡情況。

2.10 過表達或抑制miR-21對青蒿琥酯抑制CCL229細胞侵襲能力的影響

按“2.9”項下方法處理細胞，按“2.4”項下方法檢測細胞侵襲情況。

2.11 過表達或抑制miR-21對青蒿琥酯抑制CCL229細胞克隆形成的影響

按“2.9”項下方法處理細胞，按“2.5”項下方法檢測細胞克隆形成情況。

2.12 過表達或抑制miR-21對青蒿琥酯調控CCL229細胞自噬特異性蛋白及上皮間質轉化相關蛋白表達的影響

按“2.9”項下方法處理細胞，按“2.6”項下方法檢測自噬特異性蛋白及上皮間質轉化相關蛋白表達情況。

2.13 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-21與PTEN靶向關系

將和的3’-UTR靶序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游。將miR-NCmimics、miR mimics載體與、載體分別共轉染到CCL229細胞內，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，棄上清，加入0.5 mL含10%胎牛血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞。按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書檢測熒光素酶，采用酶標儀檢測螢火蟲和海腎熒光值，并以海腎熒光值作為內參。

2.14 過表達或抑制miR-21對CCL229細胞PTEN蛋白表達的影響

設置對照組、過表達組（miR mimics）、抑制劑組（miR inhibitor）。按“2.8”項下方法進行轉染，按“2.6”項下方法檢測細胞中PTEN蛋白表達情況。

2.15 CCL229細胞和HIEC細胞中PTEN蛋白表達

按“2.7”項下方法處理細胞，按“2.6”項下方法檢測細胞中PTEN蛋白表達情況。

2.16 過表達或抑制PTEN對CCL229細胞PTEN蛋白表達的影響

設置對照組、過表達陰性對照組（pc-NC）、過表達組（pc-PTEN）、抑制陰性對照組（si-NC）、抑制組（si-PTEN）和過表達聯(lián)合過表達組（pc-PTEN＋miR mimics），按“2.8”項下方法進行轉染，按“2.6”項下方法檢測CCL229細胞中PTEN蛋白表達情況。序列為：5’-GACGGGAAGACAAGUUCAUTT-3’。

2.17 過表達或抑制PTEN對青蒿琥酯降低CCL229細胞存活率的影響

設置對照組、過表達組（pc-PTEN）、抑制組（si-PTEN）和過表達聯(lián)合過表達組（pc-PTEN＋miR mimics），按“2.8”項下方法進行轉染，各組加入青蒿琥酯（20 μg/mL），培養(yǎng)24 h，按“2.2”項下方法檢測細胞存活率。

2.18 過表達或抑制PTEN對青蒿琥酯促CCL229細胞凋亡的影響

按“2.17”項下方法處理細胞，按“2.3”項下方法檢測細胞凋亡情況。

2.19 過表達或抑制PTEN對青蒿琥酯抑制CCL229細胞侵襲能力的影響

按“2.17”項下方法處理細胞，按“2.4”項下方法檢測細胞侵襲情況。

2.20 過表達或抑制PTEN對青蒿琥酯抑制CCL229細胞克隆形成的影響

按“2.17”項下方法處理細胞，按“2.5”項下方法檢測細胞克隆形成情況。

2.21 過表達或抑制PTEN對青蒿琥酯調控CCL229細胞自噬特異性蛋白及上皮間質轉化相關蛋白表達的影響

按“2.17”項下方法處理細胞，按“2.6”項下方法檢測自噬特異性蛋白及上皮間質轉化相關蛋白表達情況。

2.22 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，運用GraphPad Prism 8.2繪制統(tǒng)計圖，兩組間比較采用檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 青蒿琥酯對CCL229細胞存活率、凋亡、侵襲及克隆形成的影響

如圖1所示，青蒿琥酯（5、10、20、40 μg/mL）作用24、48、72 h均可顯著抑制CCL229細胞存活率（＜0.05、0.01、0.001），呈劑量和時間相關性；與5-氟尿嘧啶組比較，青蒿琥酯（20 μg/mL）可顯著抑制CCL229細胞活力（＜0.05），因此選擇20 μg/mL青蒿琥酯進行后續(xù)實驗。

如圖2-A所示，與對照組比較，青蒿琥酯組細胞凋亡率顯著升高（＜0.001），優(yōu)于5-氟尿嘧啶。如圖2-B所示，與對照組比較，青蒿琥酯組細胞侵襲能力顯著降低（＜0.001），優(yōu)于5-氟尿嘧啶；如圖2-C所示，與對照組比較，青蒿琥酯組細胞克隆形成能力顯著降低（＜0.001），優(yōu)于5-氟尿嘧啶。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與5-氟尿嘧啶組比較：#P＜0.05

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與青蒿琥酯組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

如圖3所示，與對照組比較，青蒿琥酯組CCL229細胞內自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復合物、Atg5、Beclin1和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），EMT相關蛋白ZO-1、E-cadherin表達水平顯著升高（＜0.01），N-cadherin和Slug蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。

3.2 miR-21在CCL229細胞內的表達及作用

如圖4-A所示，與CCL229細胞比較，HIEC細胞內mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），青蒿琥酯組CCL229細胞內mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）。如圖4-B所示，轉染過表達載體或抑制載體至CCL229細胞內，CCL229細胞內mRNA表達水平顯著升高或降低（＜0.01、0.001）。

如圖5-A所示，過表達顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞的促凋亡作用（＜0.001），抑制顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞的促凋亡作用（＜0.01）。如圖5-B所示，過表達顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞侵襲能力的抑制作用（＜0.01），抑制顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞侵襲能力的抑制作用（＜0.05）。如圖5-C所示，過表達顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.01），抑制顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.05）。

如圖6所示，過表達顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關蛋白ZO-1、E-cadherin表達水平的上調作用（＜0.05、0.01），顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞N-cadherin和Slug蛋白表達水平的下調作用（＜0.01）；抑制顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關蛋白ZO-1、E-cadherin表達水平的上調作用（＜0.05、0.01），顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞N-cadherin和Slug蛋白表達水平的下調作用（＜0.01）。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與青蒿琥酯組比較：#P＜0.05

與CCL229細胞比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與HIEC細胞比較：#P＜0.05；與對照組比較：@@P＜0.01 @@@P＜0.001

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.3 PTEN為miR-21的下游靶基因

生物信息學網站（ENCORI）預測結果如圖7-A所示，與mRNA 3’-UTR端存在部分靶向結合序列。如圖7-B所示，過表達顯著抑制CCL229細胞內PTEN蛋白表達水平（＜0.01），抑制表達顯著上調PTEN蛋白表達水平（＜0.01）。雙熒光素酶報告基因結果如圖7-C所示，過表達顯著抑制野生型PTEN（）質粒的熒光素酶活性（＜0.01），但對突變型PTEN（）質粒的熒光素酶活性無顯著影響。

3.4 青蒿琥酯通過miR-21/PTEN抑制CCL229惡性生物學行為

如圖8-A所示，與CCL229細胞比較，HIEC細胞內PTEN蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），青蒿琥酯組CCL229細胞內PTEN蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）。如圖8-B所示，轉染過表達載體或抑制載體至CCL229細胞內，CCL229細胞內PTEN蛋白表達水平顯著升高或降低（＜0.01）。

A-miR-21與PTEN mRNA靶向結合位點 B-過表達或抑制miR-21對CCL229細胞內PTEN蛋白表達的影響 C-過表達miR-21對CCL229細胞熒光素酶活性的影響；與對照組比較：##P＜0.01

與CCL229細胞比較：**P＜0.01；與HIEC細胞比較：#P＜0.05；與對照組比較：@@P＜0.01

如圖9所示，過表達顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞存活率的抑制作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞存活率的抑制作用（＜0.01）。

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

如圖10-A所示，過表達顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞的促凋亡作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞的促凋亡作用（＜0.001）。如圖10-B所示，過表達顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞侵襲能力的抑制作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞侵襲能力的抑制作用（＜0.01）。如圖10-C所示，過表達顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.05），抑制顯著減弱青蒿琥酯對CCL229細胞克隆形成能力的抑制作用（＜0.05）。

如圖11所示，過表達顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關蛋白ZO-1、E-cadherin表達水平的上調作用（＜0.05、0.01），顯著增強青蒿琥酯對CCL229細胞N-cadherin和Slug蛋白表達水平的下調作用（＜0.01）；抑制顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞自噬特異性蛋白Atg5-Atg12復合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ以及EMT相關蛋白ZO-1、E-cadherin表達水平的上調作用（＜0.05、0.01），顯著抑制青蒿琥酯對CCL229細胞N-cadherin和Slug蛋白表達水平的下調作用（＜0.01）。

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

與青蒿琥酯組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

此外，同時過表達和對青蒿琥酯抑制CCL229細胞的惡性生物學行為無顯著影響。

4 討論

青蒿素及其衍生物如蒿甲醚、青蒿琥酯、雙氫青蒿素等具有抗瘧疾、免疫調節(jié)、抗腫瘤等作用[15-17]。Efferth等[10]發(fā)現青蒿琥酯對白血病細胞和大腸癌細胞株表現出明顯的抑制作用，對黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、神經系統(tǒng)腫瘤也有一定程度的抑制作用。本研究結果顯示，青蒿琥酯可抑制CCL229細胞存活率，且呈劑量和時間相關性；青蒿琥酯可促進CCL229細胞凋亡，抑制CCL229細胞侵襲和克隆形成能力。大腸癌的復發(fā)與轉移是影響患者術后生存率的主要因素[18]。大腸癌的轉移是多步驟、多因素共同導致的結果，其中EMT發(fā)揮重要的作用[19]。EMT的發(fā)生涉及多個環(huán)節(jié)，包括細胞因子和轉錄因子表達上調、上皮標志物下調、間質標志物上調等[20]。EMT是多種癌癥侵襲和早期轉移的一個重要過程[21]，本研究結果顯示，青蒿琥酯顯著上調CCL229細胞內ZO-1和E-cadherin蛋白表達水平，顯著下調N-cadherin和Slug蛋白表達水平，表明青蒿琥酯能抑制CCL229細胞侵襲，與Transwell實驗結果一致。自噬過程是一種細胞內的降解系統(tǒng)，可將細胞質成分遞送至溶酶體并參與自噬體的形成，在細胞的發(fā)育及對外界刺激的響應中極為重要[22]。自噬過程在乳腺癌[23]、口腔癌[24]、大腸癌[25]等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，本研究結果顯示，青蒿琥酯顯著上調CCL229細胞內Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5和Atg5-Atg12復合物蛋白表達水平，表明青蒿琥酯能夠誘導CCL229細胞發(fā)生自噬。此外，本研究發(fā)現20 μg/mL青蒿琥酯對CCL229細胞惡性生物學行為的抑制作用優(yōu)于40 μg/mL 5-氟尿嘧啶。與化療藥物5-氟尿嘧啶相比，青蒿琥酯不會直接殺傷癌細胞，主要通過誘導癌細胞凋亡從而抑制癌細胞的惡性生物學行為。

研究發(fā)現，多種在大腸癌細胞株和組織中異常表達，如、、、等在大腸癌組織中呈高表達水平，、、等在大腸癌組織中呈低表達水平[26]。本研究結果顯示，相較于HIEC細胞，mRNA在CCL229細胞中表達顯著上調，過表達后CCL229細胞對青蒿琥酯的敏感性顯著降低，抑制后CCL229細胞對青蒿琥酯的敏感性顯著增加，表明參與了CCL229細胞的增殖、凋亡、侵襲及EMT等過程，青蒿琥酯可能通過下調表達，從而抑制CCL229細胞惡性生物學行為。

PTEN是重要的腫瘤抑制基因，PTEN的缺失可能會導致癌癥干細胞的惡性增殖或正常干細胞分化能力的丟失[27]，本研究發(fā)現PTEN蛋白在CCL229細胞中異常下調，過表達可顯著增強CCL229細胞對青蒿琥酯的敏感性，抑制可顯著抑制CCL229細胞對青蒿琥酯的敏感性，表明大腸癌的發(fā)生可能與PTEN表達的缺失具有一定的相關性。Jiang等[28]發(fā)現可通過影響表達促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲；Lin等[29]發(fā)現lncRNA DUXAP8通過負調控PTEN表達促進膀胱癌細胞增殖。本研究通過生物信息學網站預測的下游靶基因，結果顯示，是的下游靶基因，且過表達會顯著抑制PTEN蛋白在CCL229細胞內的表達。此外，將過表達載體與過表達載體共轉染至CCL229細胞內，并不會對青蒿琥酯的敏感性產生顯著影響，表明青蒿琥酯可能通過作用于miR-21/PTEN，從而抑制CCL229細胞的惡性生物學行為。

綜上，青蒿琥酯通過調控miR-21和PTEN的表達，從而誘導細胞發(fā)生凋亡和自噬，并抑制細胞的增殖和侵襲。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Inhibitory effect of artesunate on malignant biological behavior of human colorectal cancer CCL229 cells through miR-21/PTEN pathway

GONG Hui-jie, TANG Jian-rong, YAO Lan-jie, FENG Peng-fei

Department of Gastroenterology, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China

To explore the mechanism of inhibitory effect of artesunate on malignant biological behavior of human colorectal cancer CCL229 cells.MTT method was used to detect the effect of artesunate on viability of CCL229 cells; Flow cytometry was used to detect the effect of artesunate on apoptosis of CCL229 cells; Transwell method was used to detect the effect of artesunate on invasion of CCL229 cells; Clone formation experiment was used to detect the effect of artesunate on colony forming ability of CCL229 cells; Western blotting was used to detect the effects of artesunate on expressions of intracellular autophagy-specific proteins such as autophagy effector protein (Beclin1), light chain 3-Ⅰ/Ⅱ protein (LC3-Ⅰ/Ⅱ), autophagy related protein 5 (Atg5), Atg5-Atg12 complex, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) related proteins such as tight junction protein (ZO-1), epithelial cadherin (E-cadherin), neuronal cadherin (N-cadherin), zinc finger transcription factor (Slug) and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) in CCL229 cells; qRT-PCR was used to detect the effect of artesunate on expression ofmRNA in CCL229 cells; The dual luciferase reporter gene experiment was used to verify the targeting relationship betweenand; Effect of overexpression or inhibition ofandon biological behavior of artesunate in inhibiting CCL229 cells was investigated.Artesunate significantly inhibited the survival rate of CCL229 cells (< 0.05, 0.01, 0.001), promoted the apoptosis of CCL229 cells (< 0.001), inhibited CCL229 cell invasion and clone formation ability (< 0.001), up-regulated the expressions of Atg5-Atg12 complex, Atg5, Beclin1, LC3-Ⅰ/Ⅱ, ZO-1, E-cadherin in CCL229 cells (< 0.05, 0.01), and significantly down-regulated the expressions of N-cadherin and Slug (< 0.05). The expression ofmRNA in CCL229 cells was high (< 0.01), artesunate significantly inhibited the expression ofmRNA in CCL229 cells (< 0.05). Overexpression ofsignificantly inhibited the pro-apoptotic effect of artesunate on CCL229 cells (< 0.001), weakened the inhibitory effect of artesunate on CCL229 cell invasion and clonal formation (< 0.01), inhibited the up-regulation of artesunate on expressions of Atg5-Atg12 complex, Atg5, Beclin1, LC3-Ⅰ/Ⅱ, ZO-1, and E-cadherin in CCL229 cells (< 0.05, 0.01), and significantly inhibited the down-regulation of artesunate on expressions of N-cadherin and Slug protein in CCL229 cells (< 0.01); The inhibition ofexpression had the opposite effect.was the downstream target gene of. Overexpression ofsignificantly inhibited the expression of PTEN in CCL229 cells (< 0.01), the inhibited expression ofsignificantly upregulated the expression of PTEN (< 0.01), overexpression ofsignificantly inhibited the luciferase activity of wild-type PTEN (WT-PTEN) plasmid (< 0.01). Overexpression ofhad the same effect with inhibition ofexpression on CCL229 cells, while overexpression ofanddid not affect the inhibitory effect of artesunate on malignant biological behavior of CCL229 cells.Artesunate can induce apoptosis, autophagy and inhibit cell proliferation and invasion of CCL229 cells by regulating the expression of miR-21 and PTEN.

colorectal cancer; artesunate; miRNA; proliferation; invasion; epithelial-mesenchymal transition; autophagy; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2331 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.016

2020-12-22

河南省高等學校重點科研計劃項目（20A320085）

鞏會杰（1980—），女，碩士，主治醫(yī)師，從事肝病、炎癥性腸病、急性胰腺炎、消化道腫瘤等研究。Email: zmdgonghuijie@126.com

[責任編輯 李亞楠]