翟曉芳,秦國(guó)慶,梁曉清

心肌炎是臨床常見心肌疾病,其癥狀主要有心律失常、急性心功能不全等。研究認(rèn)為,心肌損傷如心肌細(xì)胞過(guò)度炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡等與心肌炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1],抑制心肌損傷對(duì)心肌炎的治療尤為重要。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。研究顯示,青蒿琥酯可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)/p65信號(hào)通路減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人結(jié)腸上皮細(xì)胞炎性損傷,并促進(jìn)細(xì)胞增殖,有望成為治療結(jié)腸炎的藥物[3];青蒿琥酯可通過(guò)激活黏附斑激酶/磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(FAK/PI3K/AKT)信號(hào)通路對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用,其是治療心肌缺血再灌注的替代藥物[4]。但是,還鮮見青蒿琥酯影響膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷的相關(guān)報(bào)道。TRAF6是腫瘤壞死因子受體超家族和白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵銜接分子,其可通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等過(guò)程[5]。既往研究顯示,TRAF6參與心肌損傷的發(fā)展進(jìn)程,過(guò)表達(dá)miR-506-3p可通過(guò)下調(diào)TRAF6抑制心肌組織炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌炎性損傷[6]。本研究建立LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷模型,觀察青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響及其能否通過(guò)調(diào)控TRAF6發(fā)揮作用,以期為膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

H9c2細(xì)胞,上海通派生物科技有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;青蒿琥酯,純度>98%,陜西藤邁生物科技有限責(zé)任公司;DMEM培養(yǎng)液、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)所需抗體,中國(guó)Abcam公司;白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司;TRAF6過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-TRAF6)和空載體(pcDNA),上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用完全培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9c2細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)(CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞存活率

于96孔板中接種0.2 mL H9c2細(xì)胞(5.0×104個(gè)/mL),培養(yǎng)4 h。1)分別用含0、0.1、0.2、0.4 mmol/L青蒿琥酯的培養(yǎng)液孵育24 h[3];2)加含1 μg/mL LPS[7]的培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞2 h,并依次記為L(zhǎng)PS組、LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Con組)常規(guī)培養(yǎng),既不用青蒿琥酯孵育,也不用LPS誘導(dǎo)。各組培養(yǎng)結(jié)束后,向每孔中加10 μL CCK-8,孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度(A)值。存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細(xì)胞(5.0×104個(gè)/mL),培養(yǎng)4 h后,按照上述1.2.2中的2)分組處理。各組培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞,用PBS清洗。加500 μL結(jié)合緩沖液,重懸細(xì)胞。加10 μL Annexin V-FITC,避光孵育15 min。再加5 μL PI,避光孵育5 min,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細(xì)胞(5.0×104個(gè)/mL),培養(yǎng)4 h后,按照上述1.2.2中的2)進(jìn)行分組處理。各組培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞上清液,3 500 r/min離心10 min。取上清,分別利用IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)其水平。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRAF6蛋白表達(dá)

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細(xì)胞(5.0×104個(gè)/mL),培養(yǎng)4 h后,按照上述1.2.2中的2)進(jìn)行分組處理。各組培養(yǎng)結(jié)束后,將細(xì)胞中總蛋白用RIPA試劑提取出來(lái),并檢測(cè)蛋白濃度(BCA法)。用SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)對(duì)總蛋白進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4 ℃冰箱中分別用稀釋的TRAF6和GAPDH(內(nèi)參)一抗孵育過(guò)夜,稀釋度均為1∶1 000。洗膜,用山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。加顯影液顯影,曝光拍照,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

于6孔板中接種2.5 mL H9c2細(xì)胞(5.0×104個(gè)/mL),培養(yǎng)24 h后,利用LipofectamineTM 2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-TRAF6,轉(zhuǎn)染時(shí)間為12 h,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRAF6蛋白表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。于6孔板中接種2.5 mL 轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-TRAF6的H9c2細(xì)胞(5.0×104個(gè)/mL),按照LPS組處理,記為L(zhǎng)PS+pcDNA組、LPS+pcDNA-TRAF6組;按照LPS+高青蒿琥酯劑量組處理,記為L(zhǎng)PS+青蒿琥酯+pcDNA組、LPS+青蒿琥酯+pcDNA-TRAF6組。各組細(xì)胞處理后,按照上述1.2.3至1.2.5中方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)及TRAF6蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 青蒿琥酯對(duì)心肌細(xì)胞H9c2增殖活性的影響

不同劑量(0、0.1、0.2、0.4 mmol/L)青蒿琥酯組H9c2細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(99.02±1.64)%、(98.78±1.12)%、(99.67±0.33)%,4組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.835,P=0.054)。與0 mmol/L青蒿琥酯組比較,不同劑量(0.1、0.2、0.4 mmol/L)青蒿琥酯組H9c2細(xì)胞存活率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明此濃度范圍內(nèi)的青蒿琥酯對(duì)H9c2細(xì)胞無(wú)毒性。

2.2 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2增殖活性的影響

Con組、LPS組、LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(62.14±1.70)%、(71.75±2.96)%、(80.13±1.69)%、(89.34±2.14)%,組間存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=519.352,P<0.05)。LPS組H9c2細(xì)胞存活率低于Con組(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細(xì)胞存活率均高于LPS組(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細(xì)胞存活率兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡及炎性因子的影響

LPS組H9c2細(xì)胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均高于Con組(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細(xì)胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均低于LPS組(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組各檢測(cè)指標(biāo)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

表1 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡及炎性因子表達(dá)的影響(±s)

圖1 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響

2.4 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中TRAF6蛋白表達(dá)的影響

Con組、LPS組、LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)量分別為0.12±0.01、0.74±0.06、0.54±0.04、0.34±0.03、0.24±0.02,5組間TRAF6蛋白表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=413.727,P<0.05)。LPS組H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)量高于Con組(P<0.05);LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)量均低于LPS組(P<0.05),且LPS+低青蒿琥酯劑量組、LPS+中青蒿琥酯劑量組和LPS+高青蒿琥酯劑量組H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)量?jī)蓛杀容^差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)的影響

2.5 TRAF6轉(zhuǎn)染效率

TRAF6蛋白在轉(zhuǎn)染pcDNA-TRAF6的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量為0.56±0.05,較轉(zhuǎn)染pcDNA的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量0.14±0.02升高(t=-23.398,P<0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染pcDNA-TRAF6的H9c2細(xì)胞中TRAF6較轉(zhuǎn)染pcDNA的細(xì)胞上調(diào)。詳見圖3。

圖3 TRAF6蛋白表達(dá)的檢測(cè)

2.6 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡及炎性因子表達(dá)的影響

LPS+pcDNA-TRAF6組H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均高于LPS+pcDNA組(P<0.05)。LPS+青蒿琥酯+pcDNA-TRAF6組H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均高于LPS+青蒿琥酯+pcDNA組(P<0.05)。詳見圖4、圖5及表2。

表2 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡及炎性因子表達(dá)的影響比較(±s)

圖4 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

圖5 上調(diào)TRAF6逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

心肌炎發(fā)生發(fā)展與感染、自身免疫性疾病、物理化學(xué)刺激等多種因素有關(guān)。LPS又被稱為內(nèi)毒素,是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,其可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子,產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng),進(jìn)一步誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死或凋亡,引發(fā)心肌炎[8]。本研究結(jié)果顯示,大鼠心肌細(xì)胞H9c2經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量明顯增加,且凋亡率升高,說(shuō)明LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,模型建立成功。

青蒿琥酯具有多種藥理活性。研究顯示,青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞炎性因子釋放具有顯著抑制作用,這與其抑制細(xì)胞中Toll樣受體4(TLR4)通路的活化有關(guān)[9];青蒿琥酯通過(guò)激活A(yù)KT/血紅素氧合酶(HO-1)信號(hào)通路抑制過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,提示其具有減輕白內(nèi)障的作用[10];青蒿琥酯可抑制腎缺血再灌注引起的炎性因子釋放及細(xì)胞焦亡,減輕腎缺血再灌注損傷[11];青蒿琥酯可抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥、鐵蓄積和脂質(zhì)過(guò)氧化,減輕心肌細(xì)胞鐵死亡,并增強(qiáng)細(xì)胞活力,緩解細(xì)胞損傷,提示青蒿琥酯具有心肌保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)首先觀察到一定濃度范圍的青蒿琥酯對(duì)心肌細(xì)胞H9c2無(wú)毒性,且青蒿琥酯可提高LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞增殖活性,抑制細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子,同時(shí)減少細(xì)胞凋亡,這一結(jié)果與洪莉莉等[12]研究結(jié)果基本一致,說(shuō)明青蒿琥酯可抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,提示其具有減輕或治療膿毒癥心肌損傷的作用,對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用。

有研究證實(shí),TRAF6與心肌炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。下調(diào)TRAF6可通過(guò)抑制NF-κB通路誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化,從而減輕病毒性心肌炎[14];miR-146a可通過(guò)靶向抑制TRAF6并阻礙NF-κB信號(hào)通路的激活改善心肌炎[15]。本研究顯示,心肌細(xì)胞H9c2經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)增加,而過(guò)表達(dá)TRAF6促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這提示TRAF6對(duì)心肌炎發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。為了探究青蒿琥酯能否通過(guò)調(diào)控TRAF6影響LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡,本研究檢測(cè)了其對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,青蒿琥酯呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá);同時(shí)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)TRAF6逆轉(zhuǎn)了青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎性因子及細(xì)胞凋亡的抑制作用,這提示青蒿琥酯通過(guò)下調(diào)TRAF6來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎性因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡,進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述,一定劑量的青蒿琥酯對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎性因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡具有抑制作用,這可能與其下調(diào)了細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)有關(guān),具有治療心肌炎的潛在價(jià)值。