李程彬 徐威龍 李婷 陳佳 舒茂國 賈晶

[摘要]目的：探索長鏈非編碼（Long non-coding，Lnc）RNA DANCR（Anti-differentiation nc RNA）在黑素瘤組織中表達(dá)及其對黑素瘤細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。方法：檢測黑素瘤和瘤旁組織中DANCR表達(dá)，及其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。在敲低DANCR的黑素瘤細(xì)胞株A375和B16中通過MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測敲低DANCR對細(xì)胞活性影響，通過Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1表達(dá)，并通過細(xì)胞流式檢測細(xì)胞周期分布。通過過表達(dá)DANCR檢測其是否通過AKT/GSK3β調(diào)控細(xì)胞活性。結(jié)果：DANCR在黑素瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并與黑素瘤不良臨床預(yù)后相關(guān);敲低DANCR可抑制黑素瘤細(xì)胞活性，下調(diào)p-AKT、p-GSK3β和Cyclin D1表達(dá);抑制AKT或GSK3β均可減弱DANCR過表達(dá)對細(xì)胞活性上調(diào)作用。結(jié)論：DANCR在黑素瘤中表達(dá)上調(diào)，激活A(yù)KT-GSK3β-Cyclin D1信號通路上調(diào)細(xì)胞活性，促進(jìn)黑素瘤進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]LncRNA DANCR;黑素瘤;細(xì)胞活性;增殖;AKT;GSK3β;Cyclin D1

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）03-0086-04

DANCR was Upregulated in Melanoma Tissues and Promoted Cell Viability Via AKT-GSK3β-Cyclin D1 Signaling

LI Cheng-bin，XU Wei-long，LI Ting，CHEN Jia，SHU Mao-guo，JIA Jing

（Department of Plastic，Cosmetic and Maxilofacial Surgery，the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710061，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To investigate the expression of long non-coding RNA DANCR in melanoma tissues， and the role and potential mechanism of DANCR in melanoma development. Methods? Detecting the expression of DANCR in melanoma and the adjacent tissues to analyze the relation of DANCR expression and clinical prognosis. Knocking DANCR down in melanoma cell lines， A375 and B16. Cell viability was detected using MTT and colony formation assays. Western blot assay detected the expression of p-AKT， p-GSK3β and Cyclin D1. Flow cytometry assay analyzed the distribution of cell cycle. DANCR-overexpressed cells were used to confirm that DANCR regulated cell viability via AKT/ GSK3β signaling. Results? DANCR expression was upregulated in melanoma tissues compared with the adjacent tissues， which was associated with poor clinical prognosis. Knocking DANCR down repressed cell viability and diminished expression of p-AKT， p-GSK3β and Cyclin D1. Inhibiting both p-AKT and p-GSK3β reversed DANCR overexpression induced enhancement of cell viability. Conclusion? DANCR was upregulated in melanoma cells and enhanced melanoma cell viability via modulating AKT-GSK3β-Cyclin D1 signaling.

Key words： LncRNA DANCR; melanoma; cell viability; proliferation; AKT; GSK3β; Cyclin D1

惡性黑素瘤（Melanoma）是惡性度最高的皮膚腫瘤。近年來，黑素瘤在我國發(fā)病率成倍增長[1]。一直以來，其易轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，加之目前并無針對性的治療方案，導(dǎo)致黑素瘤的愈后極差。小分子靶向藥物和免疫治療等新興療法延長了黑素瘤患者生存時(shí)間，但仍存在耐藥現(xiàn)象[2]。因此，深入研究黑素瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制以尋找新的治療靶點(diǎn)十分迫切。前期研究表明DANCR功能復(fù)雜，如對抗上皮組織細(xì)胞分化[3];抑制牙源干細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化[4-5];在一定程度上與結(jié)腸癌不良預(yù)后相關(guān)[6]。此外，DANCR還可增加肝癌組織細(xì)胞干性，促進(jìn)細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[7-8]。敲低DANCR可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[9]。本研究以DANCR為研究對象，初步探索DANCR在黑素瘤中的作用及其可能作用機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清為HyClon產(chǎn)品;DMEM為中國碧云天產(chǎn)品;第一抗體：抗p-AKT（#9611），抗AKT（#4685），抗p-GSK3β（#5558），抗GSK3β（#12456）和抗Cyclin D1（#2978）購于CST（Cell Signaling Technology）科技公司。黑素瘤細(xì)胞株A375和B16購于美國ATCC;雙抗（青霉素和鏈霉素）、EDTA，二甲基亞砜（DMSO）和四氮唑藍(lán)（MTT）購于Invitrogen公司（美國）。LY294002（L9908）和LiCl（L4408）購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定RNA干擾：人黑素瘤細(xì)胞株A375和B16分別培養(yǎng)于含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)濕度的培養(yǎng)箱中，溫度恒定于37℃。復(fù)制缺陷慢病毒用作轉(zhuǎn)染載體。其中包含了用于構(gòu)建穩(wěn)定敲除DANCR或過表達(dá)DANCR的shRNA或DANCR基因片段。慢病毒感染A375和B16細(xì)胞以構(gòu)建穩(wěn)定敲除DANCR或過表達(dá)DANCR的細(xì)胞株。實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)用于檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測：總RNA提取試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司）用于提取細(xì)胞中總RNA。1μg總RNA通過Superscript Ⅲ轉(zhuǎn)錄酶用于反轉(zhuǎn)錄（購于賽默飛）。所得反轉(zhuǎn)RNA繼續(xù)和SYBR Green共同用于qRT-PCR檢測，以分析靶基因的表達(dá)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）用作內(nèi)參。

1.2.3 Western blot檢測：RIPA細(xì)胞裂解液中加入蛋白酶抑制劑，之后用于裂解細(xì)胞。所提取的細(xì)胞裂解液離心留取蛋白溶解液，用Bradford法檢測蛋白濃度。之后每組吸取30μg蛋白加入12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。待蛋白完全分離后，轉(zhuǎn)移分離開的蛋白條帶至硝化纖維素（Nitrocellulosefilter，NC）膜上。用5%的脫脂牛奶室溫孵育NC膜1h以封閉膜上非特異性結(jié)合位點(diǎn)。之后用特異性一抗在4℃孵育NC膜過夜。反復(fù)清洗NC膜，之后用辣根過氧化物酶二抗孵育NC膜，用成像儀觀察蛋白條帶。

1.2.4 組織獲取和激光捕獲微檢測：該研究所用標(biāo)本為2014年6月-2017年9月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的黑素瘤患者腫瘤標(biāo)本。該研究經(jīng)過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并全程遵循相關(guān)規(guī)定。標(biāo)本收取和使用前，與患者進(jìn)行了充分的溝通并簽署相關(guān)知情同意書。該研究遵循了1964年赫爾辛基公告及其之后的修訂。在病理醫(yī)生指導(dǎo)下，激光捕獲法分別切取黑素瘤組織和瘤旁組織。切割下的組織進(jìn)行裂解并提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后行qRT-PCR檢測相應(yīng)基因表達(dá)情況。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞種于6孔板中（1 000細(xì)胞/孔），連續(xù)培養(yǎng)約兩周至單個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)量約50細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基，以4%多聚甲醇固定培養(yǎng)板中細(xì)胞，結(jié)晶紫染色約10min后，PBS洗滌培養(yǎng)板三遍，最終攝像并計(jì)數(shù)每孔中細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.2.6 四氮唑藍(lán)（MTT）比色檢測：MTT檢測用于檢測細(xì)胞活性。5×103細(xì)胞種于96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后改用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，或者用不同抑制劑處理。不同處理后細(xì)胞更換新鮮無血清培養(yǎng)基，加入MTT試劑（0.5mg/ml）在37℃培養(yǎng)4h。之后小心移除培養(yǎng)基，再加入150μl的DMEM，輕柔震動使結(jié)晶充分溶解，在490nm波長下使用微盤分析儀讀取各孔結(jié)晶濃度。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至密度為60%～80%時(shí)即用胰酶/EDTA消化細(xì)胞以獲取細(xì)胞。獲取的細(xì)胞用PBS洗滌后，重懸于預(yù)冷的70%甲醇中，繼續(xù)在-20℃環(huán)境中放置24h。檢測前，離心以去除甲醇，繼續(xù)用冷PBS清洗兩次。之后再細(xì)胞中加入RNAse A （0.5μg/ml）和碘化丙啶（50μg/ml），繼續(xù)在室溫下培養(yǎng)于黑暗中。30min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究使用GraphPad prism 5軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析，Students t檢測用于兩組之間差異的統(tǒng)計(jì)分析。對于三組及以上各組間差異分析，用SPSS 17.0軟件通過單因素方差分析（ANOVA）和Fisher最小顯著性差異進(jìn)行分析比較。P<0.05被定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 DANCR在惡性黑素瘤患者組織中表達(dá)情況：惡性黑素瘤患者中DANCR表達(dá)明顯高于瘤旁組織（P<0.05），見圖1A。進(jìn)一步分析可知，DANCR的表達(dá)水平會隨著T分期升高而呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，見圖1B。將黑素瘤患者按照DANCR表達(dá)水平分為兩組，分析其生存時(shí)間可知：DANCR高表達(dá)組生存預(yù)后較DANCR低表達(dá)組差，見圖1C。

2.2 敲低DANCR抑制惡性黑素瘤細(xì)胞活性：為進(jìn)一步闡述DANCR在黑素瘤細(xì)胞中高表達(dá)所發(fā)揮的作用，使用攜帶靶向DANCR的short hairpin（sh）RNA慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞處理A375和B16，從而得到DANCR含量較低的目標(biāo)細(xì)胞株，見圖2A。通過MTT檢測可見，敲低DANCR可抑制A375和B16的細(xì)胞活力，見圖2B。同樣，克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)：敲低DANCR可抑制其克隆形成能力，見圖2C。

2.3 敲低DANCR下調(diào)AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路并抑制細(xì)胞周期：為了探索DANCR調(diào)控A375和B16細(xì)胞活性的潛在分子機(jī)制，用Western-Blot檢測了目標(biāo)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明：敲低DANCR的A375和B16細(xì)胞中p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1蛋白水平均出現(xiàn)了不同程度的下降，見圖3A。此外，細(xì)胞周期檢測分析可見，敲低DANCR可抑制細(xì)胞周期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)換，更多細(xì)胞停留于G1期，見圖3B。

2.4 DANCR通過AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路調(diào)控黑素瘤細(xì)胞活性：為了證實(shí)AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路在DANCR調(diào)控細(xì)胞活動中所發(fā)揮的作用，用慢病毒為載體構(gòu)建了DANCR過表達(dá)的細(xì)胞模型并檢測轉(zhuǎn)染效果，見圖4A。Western-Blot檢測可見，DANCR過表達(dá)上調(diào)p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1蛋白表達(dá)。而用LY294002在DANCR過表達(dá)細(xì)胞中抑制p-AKT活性后，可見p-AKT，p-GSK3β和Cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，見圖4B。DANCR過表達(dá)也可促進(jìn)A375和B16細(xì)胞活性，同樣，LY294002可抑制DANCR過表達(dá)所引起的細(xì)胞活性增加，見圖4C。與其相一致的是，克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示DANCR過表達(dá)可促進(jìn)克隆形成，而LY294002可減弱該促進(jìn)作用，見圖4D。用LiCl抑制GSK3β以驗(yàn)證其在DANCR調(diào)控細(xì)胞活性中的作用。Western-Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制GSK3β可有效逆轉(zhuǎn)DANCR過表達(dá)誘導(dǎo)的Cyclin D1上調(diào)，見圖4E。同樣，抑制GSK3β也可下調(diào)DANCR過表達(dá)引起的細(xì)胞活性增加（見圖4F）和克隆形成增強(qiáng)（見圖4G）綜上所述，圖4結(jié)果證實(shí)了AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路在DANCR調(diào)控細(xì)胞活性中所發(fā)揮的重要作用。

3? 討論

近年來，關(guān)于黑素瘤相關(guān)分子機(jī)制的研究取得了巨大的進(jìn)展[10]，由于黑素瘤具有高度的侵襲性和強(qiáng)烈的致死性，黑素瘤患者仍不能逃離復(fù)發(fā)和死亡的命運(yùn)[11]。因此，深入理解黑素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，將幫助挖掘新的靶點(diǎn)，為改善黑素瘤患者臨床預(yù)后提供可能性。

隨著非編碼RNA在生物進(jìn)程中的重要作用被不斷揭示，其功能研究和其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究為攻克黑素瘤提供了新的方向。LncRNAs是一組內(nèi)源性非蛋白編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA），其在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中不同層面所發(fā)揮的作用也被不斷報(bào)道[12]。研究表明，很多LncRNA，如HOTAIR，MALAT1，BANCR，ANRIL，SAMMSON和SPRY-IT1，在黑素瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲遷移中發(fā)揮重要作用[12]。前期研究證實(shí)，LncRNA DANCR在多種腫瘤的進(jìn)展作用重要，但目前關(guān)于DANCR在黑素瘤進(jìn)展中作用尚不清楚。發(fā)現(xiàn)DANCR在黑素瘤組織中較瘤旁組織表達(dá)上調(diào)，與黑素瘤患者不良臨床愈合密切相關(guān)。介于黑素瘤往往帶來較差的臨床結(jié)局，以及其對傳統(tǒng)治療反應(yīng)性較差，早期發(fā)現(xiàn)和診斷黑素瘤，進(jìn)而早期進(jìn)行臨床干預(yù)，就顯得尤為重要。因此，DANCR有望作為黑素瘤的一個(gè)新的診斷指標(biāo)或成為黑素瘤治療后臨床進(jìn)展的檢測指標(biāo)。

PI3K/AKT信號通路在多種皮膚癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此，很多靶向PI3K/AKT的藥物被不斷挖掘出來，并證實(shí)可用于癌癥治療[13]。PI3K/AKT信號通路通過靶向相應(yīng)靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖、粘附、侵襲遷移和血管生成。已有研究證實(shí)，PTEN缺失和PI3K/AKT信號通路激活可見于大多黑素瘤[14]，而靶向抑制PI3K/AKT及其下游分子也可抑制黑素瘤進(jìn)展[15]。本次研究結(jié)果提示，DANCR在黑素瘤中表達(dá)上調(diào)，通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。GSK3β是AKT信號通路的重要下游分子，在腫瘤進(jìn)展中作用重要[16]。研究發(fā)現(xiàn)，DANCR上調(diào)GSK3β表達(dá)，而用LiCl抑制GSK3β可有效逆轉(zhuǎn)DANCR過表達(dá)所有誘導(dǎo)的細(xì)胞活性上調(diào)。

目前靶向PI3K/AKT信號通路的靶向藥物不斷問世，但前期臨床實(shí)驗(yàn)顯示其效果仍欠理想[17]。而研究中所揭示的DANCR-AKT-GSK3β信號通路調(diào)控Cyclin D1表達(dá)影響黑素瘤細(xì)胞周期，有望為其治療提供新的靶點(diǎn)。此外，PI3K/AKT信號通路在癌細(xì)胞侵襲遷移中同樣作用重要;而DANCR也可促腫瘤侵襲遷移。考慮黑素瘤強(qiáng)侵襲遷移特性，靶向DANCR有望成為黑素瘤臨床治療的一個(gè)靶標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，DANCR在黑素瘤組織中表達(dá)上調(diào)，可激活A(yù)KT-GSK3β-Cyclin D1通路發(fā)揮作用。這一發(fā)現(xiàn)為DANCR作為黑素瘤臨床治療補(bǔ)充靶點(diǎn)或作為黑素瘤診斷和預(yù)后的分子指標(biāo)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李薈元.國外美容醫(yī)學(xué)最新研究與進(jìn)展（九）-惡性黑色素瘤[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2017，26（11）：148-149.

[2]Barquet-Munoz SA，Leitao M，Perez MM，et al.Vulvar melanoma： management of primary disease and repeated recurrences[J].Int J Gynecol Cancer，2019，29（6）：1077-1081.

[3]Kretz M，Webster DE，F(xiàn)lockhart RJ，et al.Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR[J].Genes Dev，2012，26（4）：338-343.

[4]Jia Q，Chen X，Jiang W，et al.The regulatory effects of long noncoding rna-ancr on dental tissue-derived stem cells[J].Stem Cells Int，2016，2016：3146805.

[5]Jia Q，Jiang W，Ni L.Down-regulated non-coding RNA （lncRNA-ANCR） promotes osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells[J].Arch Oral Biol，2015，60（2）：234-241.

[6]Liu Y，Zhang M，Liang L，et al.Over-expression of lncRNA DANCR is associated with advanced tumor progression and poor prognosis in patients with colorectal cancer[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（9）：11480-11484.

[7]Ma X，Wang X，Yang C，et al.DANCR acts as a diagnostic biomarker and promotes tumor growth and metastasis in hepatocellular

carcinoma[J].Anticancer Res，2016，36（12）：6389-6398.

[8]Yuan SX，Wang J，Yang F，et al.Long noncoding RNA DANCR increases stemness features of hepatocellular carcinoma by derepression of CTNNB1[J].Hepatology，2016，63（2）：499-511.

[9]Li Z，Hou P，F(xiàn)an D，et al.The degradation of EZH2 mediated by lncRNA ANCR attenuated the invasion and metastasis of breast cancer[J].Cell Death Differ，2017，24（1）：59-71.

[10]秦琴，寧花蘭，陳小燕，等.miR-let-7b通過調(diào)控相關(guān)細(xì)胞周期蛋白影響皮膚黑色素瘤的增殖和凋亡[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2018，27（7）：79-82.

[11]高正君，謝沛霖，司小強(qiáng)，等.不同來源黑色素瘤BRAF V600E基因突變分析[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2018，27（1）：74-76.

[12]Yu X，Zheng H，Tse G，et al.Long non-coding RNAs in melanoma[J].Cell Prolif，2018，51（4）：e12457.

[13]張斌斌，王湘琦，趙超然，等.阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的人皮膚黑素瘤細(xì)胞株A375凋亡的機(jī)制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（8）：72-76.

[14]地里夏提·庫爾班，陳召.Notch1調(diào)控PI3K/AKT信號通路促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞發(fā)展的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（1）：93-96.

[15]Lim HN，Baek SB，Jung HJ.Bee venom and its peptide component melittin suppress growth and migration of melanoma cells via inhibition of PI3K/AKT/mTOR and MAPK pathways[J].Molecules，2019，24（5）：929.

[16]Wickenden JA，Watson CJ.Key signalling nodes in mammary gland development and cancer. Signalling downstream of PI3 kinase in mammary epithelium： a play in 3 Akts[J].Breast Cancer Res，2010，12（2）：202.

[17]Vahidnezhad H，Yousse FAL，Uitto J.Molecular genetics of the PI3K-AKT-mTOR pathway in genodermatoses： diagnostic implications and treatment opportunities[J].J Invest Dermatol，2016，136（1）：15-23.

[收稿日期]2020-03-16

本文引用格式：李程彬，徐威龍，李婷，等.DANCR通過AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路調(diào)控黑素瘤細(xì)胞活性機(jī)制的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（3）：86-90.