孫春山 李金輝 劉 磊

鄭州人民醫(yī)院泌尿外科，河南省鄭州市 450000

2019年數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌發(fā)病率占男性惡性腫瘤的19%，已成為全世界范圍內(nèi)威脅男性健康的重大問題之一[1]。盡管前列腺癌已在激素治療、免疫治療和化療等方面取得了巨大進(jìn)步，但總體預(yù)后并不理想[2]。RhoGTP酶激活蛋白10(RhoGTPase activating protein 10,ARHGAP10)是RhoGTP酶激活蛋白家族(RhoGAPs)成員，可通過影響RhoGTP酶活性在細(xì)胞骨架重組和極性生長等過程中發(fā)揮重要作用[3]。既往研究指出，ARHGAP10是一個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的調(diào)控因子，在肺癌、胃癌和卵巢癌等腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用[4-6]，在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[7]；然其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制尚不清楚。本研究擬分析ARHGAP10異位表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞功能的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%CO2、飽和濕度和37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。將細(xì)胞分為對(duì)照(CN)組、陰性對(duì)照(NC)組和ARHGAP10組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；將對(duì)數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞種植6孔板后，參照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000(美國Invitrogen)說明書將pcDNA3.1空載體質(zhì)粒和pcDNA3.1-ARHGAP10過表達(dá)載體質(zhì)粒(上海雅吉生物科技有限公司)分別轉(zhuǎn)染至NC組和ARHGAP10組中。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega)說明書將RNA合成cDNA；以cDNA 作為模板，參照熒光定量PCR試劑盒(中國Biomiga)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算PC-3細(xì)胞中ARHGAP10的表達(dá)水平。其中，PCR引物(由上海生工生物合成)如下：ARHGAP10正向引物為5’-CTGCTCCGTTTGGTTCCAGTTG-3’，反向引物為5’-GGAGTCAGTATGCCTCTTGGTAC-3’。

1.3 Western blotting 參照總蛋白提取試劑盒(北京索萊寶)說明書抽提PC-3細(xì)胞總蛋白后，二喹啉甲酸法檢測蛋白的濃度與純度；取50μg蛋白樣品上樣至SDS-PAGE行電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上；以脫脂奶粉封閉后，加入ARHGAP10(1∶800)抗體(武漢三鷹生物)和Ki67(1∶500)、MMP-2(1∶1 000)、E-cadherin(1∶800)、Vimentin(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)抗體(美國Santa Cruz)4℃孵育過夜；次日，以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000，北京中杉金橋)室溫孵育2h。發(fā)光劑顯影曝光后，以GAPDH為內(nèi)參照，采用凝聚成像分析系統(tǒng)(北京六一)掃描分析PC-3細(xì)胞中ARHGAP10、Ki67、MMP-2、E-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bax、AKT、p-AKT和β-catenin 蛋白的表達(dá)水平。

1.4 MTT檢測 收集對(duì)數(shù)生長期的CN組、NC組和ARHGAP10組PC-3細(xì)胞，以每孔105個(gè)接種至96孔板上，分別在培養(yǎng)24、48、72和96h時(shí)，每孔加入20μl 0.5%MTT溶液(北京索萊寶)孵育4h；再加入150μl二甲基亞砜震蕩反應(yīng)10min；采用酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD)在450nm處檢測PC-3細(xì)胞的OD值。

1.5 Transwell檢測 (1)侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel按照1∶8比例稀釋后，取50μl對(duì)Transwell小室底部上室面進(jìn)行包被；收集轉(zhuǎn)染48h后各組PC-3細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml；在24孔板內(nèi)加入含血清培養(yǎng)基500μl，放入Transwell小室后，在小室上室中加入細(xì)胞懸液100μl。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜后，將Transwell小室取出；以棉簽擦去上層殘留的細(xì)胞，多聚甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色20min；以磷酸緩沖液沖洗晾干，采用倒置顯微鏡于200倍下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。(2)遷移實(shí)驗(yàn)：除了無須以Matrigel包被Transwell小室底部上室面外，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集轉(zhuǎn)染48h后的各組PC-3細(xì)胞，磷酸緩沖液沖洗3次后，1 000r/min離心5min收集細(xì)胞；加入結(jié)合緩沖液400μl重懸細(xì)胞后，取細(xì)胞懸液200μl(濃度105個(gè)/ml)于EP管中，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，避光孵育15min后，上流式細(xì)胞儀(美國BD)檢測PC-3細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的影響 與CN組比較，NC組PC-3細(xì)胞中ARHGAP10 mRNA和蛋白表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但ARHGAP10組細(xì)胞中ARHGAP10 mRNA和蛋白表達(dá)水平較CN組和NC組均明顯升高(P<0.05)。與CN組和NC組比較，ARHGAP10組細(xì)胞增殖活力和Ki67蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的影響

2.2 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲遷移的影響 與CN組比較，NC組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移能力以及MMP-2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC組比較，ARHGAP10組細(xì)胞侵襲、遷移能力和MMP-2、Vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲遷移的影響

2.3 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的影響 CN組和NC組PC-3細(xì)胞凋亡率和Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但ARHGAP10組PC-3細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平明顯高于CN組和NC組，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于CN組和NC組(P<0.05)。見圖3。

圖3 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的影響

2.4 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞中AKT/β-catenin通路影響 CN組和NC組PC-3細(xì)胞中AKT/β-catenin通路相關(guān)基因AKT、p-AKT、β-catenin蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但ARHGAP10組細(xì)胞中p-AKT、β-catenin蛋白表達(dá)水平較CN組和NC組明顯降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 上調(diào)ARHGAP10對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞中AKT/β-catenin通路影響

3 討論

ARHGAPs是細(xì)胞內(nèi)重要的分子開關(guān)，可識(shí)別水解GTP，導(dǎo)致Rho族蛋白功能失活，是Rho家族蛋白的特異性抑制因子；ARHGAPs異常表達(dá)與包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。在關(guān)于前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-940可通過靶向調(diào)控ARHGAP1誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表型[10]；ARHGAP21通過調(diào)節(jié)Rho-GTPases參與前列腺癌能量代謝的調(diào)控[11]。ARHGAP29與前列腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其過表達(dá)具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用[12]。ARHGAP10是ARHGAPs中的一員，也是一種重要的腫瘤抑制因子。ARHGAP10在胃癌中表達(dá)下調(diào)，且在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[13]。另外，ARHGAP10的異位表達(dá)可通過抑制VEGF、MMP9蛋白表達(dá)和Wnt通路活化等抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲與遷移[4]。近年來有研究報(bào)道，ARHGAP10在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其低表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[7]；但ARHGAP10在前列腺癌中的作用未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ARHGAP10表達(dá)后，PC-3細(xì)胞增殖活力明顯降低，并且細(xì)胞增殖核抗原Ki67蛋白的表達(dá)水平也明顯減弱，提示ARHGAP10可能發(fā)揮抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物之一，在促進(jìn)上皮細(xì)胞形態(tài)改變、增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力過程中起著重要作用，而E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志物之一，具有增強(qiáng)細(xì)胞間黏連的作用[14-15]。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族成員，可通過特異性降解基底膜的主要成分Ⅳ、Ⅴ型膠原在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ARHGAP10后，PC-3細(xì)胞侵襲遷移能力明顯減弱，同時(shí)MMP-2和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，提示上調(diào)ARHGAP10可通過調(diào)控MMP-2、Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)抑制PC-3細(xì)胞侵襲遷移。Bcl-2和Bax均為Bcl-2蛋白家族成員，前者具有拮抗細(xì)胞凋亡的作用，Bax可促進(jìn)凋亡[16]。本研究進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ARHGAP10可使PC-3細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示ARHGAP10具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用。因此，ARHGAP10可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲遷移和凋亡在前列腺癌中發(fā)揮抑癌作用。

AKT又名蛋白激酶B，是細(xì)胞內(nèi)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，位于多種信號(hào)通路的交叉點(diǎn)，p-AKT為AKT的活化形式，AKT活化后可通過調(diào)控下游一系列的效應(yīng)分子在細(xì)胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用；β-catenin不僅是一種重要的黏附因子，也是Wnt通路下游的關(guān)鍵分子，可與E-cadherin、TCF/LEF和α-連環(huán)鏈蛋白等相互作用，與細(xì)胞間黏附和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；AKT活化可促進(jìn)β-catenin入核與轉(zhuǎn)錄，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移和抑制凋亡等過程中起著重要作用[17-18]。有研究指出，前列腺癌中ARHGAP10表達(dá)和β-catenin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[7]；而ARHGAP10過表達(dá)可通過阻斷AKT信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。本研究進(jìn)一步探討ARHGAP10在前列腺癌中的抑癌機(jī)制發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ARHGAP10后PC-3細(xì)胞中AKT/β-catenin通路關(guān)鍵分子AKT、β-catenin mRNA和p-AKT、β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯降低。結(jié)果表明，上調(diào)ARHGAP10可抑制PC-3細(xì)胞中AKT/ β-catenin通路的活化。提示在前列腺癌中ARHGAP10可能通過調(diào)控AKT/β-catenin途徑影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，上調(diào)PC-3細(xì)胞中ARHGAP10表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、侵襲遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制AKT/β-catenin通路有關(guān)。ARHGAP10在前列腺癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用，其可能是前列腺癌分子治療的潛在靶點(diǎn)。