李宇宇，賈玉山*，格根圖，王志軍，都帥，孫林，降曉偉，吳洪新，侯美玲，陳喜梅

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草業(yè)產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028000；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原勘察規(guī)劃院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019）

飼用草產(chǎn)品是以牧草、作物和農(nóng)副產(chǎn)品為原料經(jīng)收獲、調(diào)制、加工、檢測(cè)等環(huán)節(jié)生產(chǎn)出符合一定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，適合于流通的牧草產(chǎn)品［1］。飼用草產(chǎn)品是我國(guó)草食畜牧業(yè)發(fā)展的重要日糧基礎(chǔ)，同時(shí)也是我國(guó)草牧業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要組成部分［2-3］。隨著我國(guó)居民消費(fèi)水平的不斷提高和膳食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人們對(duì)畜產(chǎn)品的需求發(fā)生由量到質(zhì)的轉(zhuǎn)變［4］，生產(chǎn)綠色無(wú)污染健康的畜產(chǎn)品關(guān)鍵在于飼用草產(chǎn)品的安全，因此，飼用草產(chǎn)品質(zhì)量安全逐漸成為當(dāng)前社會(huì)和相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜腋叨汝P(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。飼用草產(chǎn)品易在收獲、加工、貯藏及運(yùn)輸過(guò)程中遭受真菌性病害污染，引發(fā)真菌毒素產(chǎn)生，導(dǎo)致其品質(zhì)劣變；飼用草產(chǎn)品中的真菌毒素不僅對(duì)家畜肝臟、腎臟、免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生不可逆危害，而且通過(guò)食物鏈蓄積而殘留在畜產(chǎn)品中，引發(fā)畜產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)人類身體健康埋下安全隱患；飼用草產(chǎn)品中的真菌毒素對(duì)人類及家畜的危害越來(lái)越受到人們的重視［5-6］。

真菌毒素（mycotoxin）是一類微生物在適宜條件下產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物［7］。飼用草產(chǎn)品中若發(fā)生真菌性病害，其分布范圍廣、污染面積大、極易積聚且分解難度大［8］。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）統(tǒng)計(jì)，全球每年大概有1/4的飼料作物受到真菌毒素不同程度的污染，其中2%的飼料作物會(huì)因污染嚴(yán)重造成直接浪費(fèi)，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元［9］。我國(guó)飼用草產(chǎn)品中真菌毒素的污染狀況更是不容樂(lè)觀，大部分存在于干草和青貯飼料中，少部分存在于成型飼草產(chǎn)品［5，10-11］。青貯飼料中真菌毒素的檢出率高達(dá)70%～100%，飼草原料和干草中均受到不同程度真菌毒素的污染，少則檢出2～3種，多則高到7～8種，高溫潮濕的南方地區(qū)檢出率更是高于北方［12］。近年來(lái)，飼用草產(chǎn)品受到真菌毒素污染，嚴(yán)重影響了其質(zhì)量安全和進(jìn)出口貿(mào)易，同時(shí)也對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)和飼用草產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展造成不利影響［11］，部分發(fā)達(dá)國(guó)家開始投入大量的資源開展飼用草產(chǎn)品中真菌毒素檢測(cè)技術(shù)、產(chǎn)生機(jī)理、降解規(guī)律和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究［13-14］。

目前，飼草飼料中發(fā)現(xiàn)的真菌毒素種類高達(dá)400多種，其化學(xué)、生物學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)各不相同［15］。家畜采食一定量被真菌毒素污染的飼用草產(chǎn)品后會(huì)導(dǎo)致家畜NDA損傷和細(xì)胞中毒，攝入量太高可對(duì)家畜動(dòng)物和人體健康造成危害，使肝臟、腎臟和胃腸道發(fā)生病變，生長(zhǎng)受到抑制，甚至?xí)l(fā)生一系列致癌、致畸、致突變等現(xiàn)象［12，16-17］。因此，充分了解飼用草產(chǎn)品中真菌毒素污染狀況、污染途徑和影響因素，并有計(jì)劃、有重點(diǎn)地采取有效方法進(jìn)行檢測(cè)和防控，對(duì)提高飼用草產(chǎn)品的安全性和保障家畜及人類健康有著重要的現(xiàn)實(shí)意義和科學(xué)意義。

1 飼用草產(chǎn)品中主要真菌毒素種類、污染狀況及其毒性

自20世紀(jì)中葉以來(lái)，人類逐漸認(rèn)識(shí)到真菌毒素的存在及危害性。1991年Hawksworth［18］經(jīng)過(guò)調(diào)查研究，自然界存在的真菌物種多達(dá)150萬(wàn)種。飼用草產(chǎn)品中的真菌毒素種類多、危害大、污染可控制性差，難以避免，不易消除。影響飼用草產(chǎn)品質(zhì)量安全且普遍存在的真菌毒素主要為以下6種：黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素（T-2 mycotoxin，T-2）、伏馬毒素（fumonisins，F(xiàn)B），每種毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物毒性及特點(diǎn)各不相同［19-23］。

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素是黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）和G2（AFG2）4種，AFB1和AFB2主要由黃曲霉產(chǎn)生，AFG1和AFG2主要由寄生曲霉產(chǎn)生。黃曲霉毒素主要污染青貯玉米（Zea mays）、苜蓿（Medicago sativa）干草、燕麥（Avena sativa）干草及稻草（Oryza sativa），易發(fā)生在飼草收獲、加工和儲(chǔ)備各個(gè)環(huán)節(jié)［24］，其中污染范圍最廣、毒性最強(qiáng)的為AFB1。飼用草產(chǎn)品存放在相對(duì)溫度25～30℃、相對(duì)濕度80%～90%的環(huán)境中，黃曲霉毒素檢出率最高。黃曲霉毒素物理性質(zhì)穩(wěn)定，被家食草畜采食后不易消化排泄出去，極易富集在家畜的肝臟、腎臟等器官上，輕者引發(fā)嘔吐、厭食等現(xiàn)象，重則會(huì)引發(fā)肝癌甚至導(dǎo)致死亡。大部分反芻家畜瘤胃微生物對(duì)AFB1極其敏感，長(zhǎng)久飼喂被AFB1污染的飼草產(chǎn)品，動(dòng)物生長(zhǎng)繁殖及肉、奶和毛等一系列畜產(chǎn)品品質(zhì)會(huì)受影響，進(jìn)一步威脅人類健康［25］。部分單胃動(dòng)物采食被AFB1污染的飼料后會(huì)導(dǎo)致其生長(zhǎng)速率下降，肝損傷，免疫力降低，導(dǎo)致其他一系列疾病的產(chǎn)生。Krnjaja等［26］對(duì)來(lái)自塞維利亞共和國(guó)10個(gè)地區(qū)農(nóng)場(chǎng)中的飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)苜蓿干草和青貯飼料樣品中AF污染率高達(dá)98.5%，燕麥干草中AF的平均濃度為7.9μg·kg-1。

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素是曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）等霉菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的主要有赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB）和赭曲霉毒素C（ochratoxin C，OTC）3種，其中飼用草產(chǎn)品中OTA對(duì)谷物類及禾本科類飼料原料污染嚴(yán)重，其毒性僅次于AFB1、穩(wěn)定性較強(qiáng)，不易降解，廣泛存在于飼草料和谷類食物中［27］。具有潛在的致癌性，致突變性，致畸性，持續(xù)飼喂被OTA污染的飼草產(chǎn)品會(huì)對(duì)家畜腎臟、肝臟、腸道及免疫系統(tǒng)造成損傷［28］，被動(dòng)物采食后會(huì)在畜產(chǎn)品中殘留，如蛋類、乳制品類，經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，危害其健康。魏娜［29］研究發(fā)現(xiàn)，拉薩市100份飼用草產(chǎn)品中檢出OTA的含量最高為258.8μg·kg-1，是限量值的2.5倍；Sherazi等［30］對(duì)巴基斯坦286份飼用草產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OTA檢出含量為75μg·kg-1；鄭會(huì)超等［31］采集了羊草（Leymus chinensis）、苜蓿、稻草等粗飼料樣品，均檢出OTA，其對(duì)飼用草產(chǎn)品污染最廣。

1.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，是由粉紅鐮刀菌（Fusarium roseum）和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物［32］，廣泛存在于飼用草產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品中，尤其在潮濕地區(qū)更易滋生。家畜采食一定量被ZEN污染的飼草可引起動(dòng)物流產(chǎn)、死胎等生殖機(jī)能異常，生長(zhǎng)緩慢、不育、畸形等現(xiàn)象；該毒素能導(dǎo)致類雌性激素增加，人類如果攝入被ZEN污染的食物或畜產(chǎn)品后，會(huì)造成人體內(nèi)生殖系統(tǒng)機(jī)能紊亂，且經(jīng)胃腸道消化后可轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的代謝物，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡［33］。大量的青貯飼料中存在ZEN污染情況，Cheli等［34］報(bào)道，青貯飼料中ZEN不受厭氧和酸性條件影響，表明青貯條件下的ZEN不易被降解；孫國(guó)君等［35］研究表明不同季節(jié)對(duì)苜蓿青貯飼料中ZEN含量有顯著影響，一般秋季最低，夏季最高。

1.4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱嘔吐毒素，主要是禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物［36］。DON是一種非揮發(fā)性的無(wú)色針狀結(jié)晶，被家畜采食后在胃內(nèi)不易水解，對(duì)中性或酸性環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)［37］。DON不僅在燕麥、苜蓿、玉米、谷類等飼草作物檢出，在大部分畜產(chǎn)品中均發(fā)現(xiàn)殘留；低溫、潮濕的環(huán)境更有利于DON的生長(zhǎng)和繁殖［38］。家畜采食被DON污染的飼料會(huì)出現(xiàn)嘔吐、拒絕采食、生殖紊亂、消化系統(tǒng)失調(diào)等現(xiàn)象；豬是對(duì)DON最為敏感的家畜動(dòng)物之一，飼料中DON的污染率達(dá)到0.6～2.0 mg·kg-1時(shí)會(huì)導(dǎo)致其體增重嚴(yán)重下降［39］。人類誤食大量被DON污染的糧食或畜產(chǎn)品會(huì)出現(xiàn)貧血、頭痛、嘔吐、厭食和腹痛等癥狀［40-41］。DON的污染范圍分布于全球，中國(guó)、日本、美國(guó)、南非等地區(qū)均有報(bào)道，謝文梅等［42］調(diào)查研究表明，2017年中國(guó)飼料及原料受真菌毒素影響較大，其中ZEN及DON的檢出率達(dá)到100%，但均未超過(guò)我國(guó)飼料原料DON的最高限量。2018年上半年飼料及原料樣品中真菌毒素污染嚴(yán)重，其中DON檢出率達(dá)到90%以上，超標(biāo)率達(dá)17.7%，嚴(yán)重污染了我國(guó)的飼料及飼料原料［43］；Boudra等［44］研究發(fā)現(xiàn)玉米青貯飼料含有大量DON，該毒素能夠降低玉米青貯飼料中的干物質(zhì)含量且縮短貯藏時(shí)間。

1.5 T-2毒素

T-2毒素是由鐮刀菌（Fusarium）產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，是一種單端孢霉烯族倍半萜烯化合物，屬于毒性最強(qiáng)的A型單端孢菌毒素［45］，家畜采食大量被T-2毒素污染的飼草會(huì)出現(xiàn)全身性出血、尿酸鹽沉積、上消化道出現(xiàn)炎癥和口腔潰瘍等現(xiàn)象［46］。該毒素的污染遍布全球，在我國(guó)飼草料中的檢出率達(dá)高達(dá)80%［47］。如果家畜采食大量被T-2毒素污染的飼草會(huì)抑制動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，影響動(dòng)物的免疫和代謝功能，該毒素主要作用于活躍的增殖細(xì)胞，破壞原始細(xì)胞活性等［48］。此外，T-2還具有強(qiáng)大的遺傳特性，會(huì)影響細(xì)胞的正常發(fā)育，表現(xiàn)出致畸作用。李梅［49］對(duì)我國(guó)6省飼料玉米中真菌毒素污染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)T-2毒素的污染率最高，達(dá)23.74%；陳心儀［50］分析測(cè)定我國(guó)18個(gè)地區(qū)的176份飼草料樣品，發(fā)現(xiàn)T-2毒素的檢出率達(dá)到100%，T-2毒素不同程度的污染著我國(guó)飼草料。

1.6 伏馬毒素

伏馬毒素是串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，又稱煙曲霉（Aspergillus fumigatus）毒素，具有耐熱性［51］，在飼用草產(chǎn)品加工過(guò)程中易產(chǎn)生，發(fā)生后不易消除。目前，已知的伏馬毒素種類16種，主要分為伏馬毒素A（FA1）、伏馬毒素B（FB1和FB2）、伏馬毒素C（FC）和伏馬毒素P（FP）四大類，其中毒素最強(qiáng)的為FB1，為總FB毒素的70%～80%。中國(guó)飼料產(chǎn)品中FB毒素污染面積廣、檢出率高［52］。2016年，百奧明公司從檢測(cè)的1769份飼料及原料樣品發(fā)現(xiàn)FB含量最高，F(xiàn)B嚴(yán)重危害著飼料及飼料原料。如果家畜采食大量被FB污染的飼草，會(huì)導(dǎo)致家畜神經(jīng)中毒、降低免疫能力、加快器官衰竭，具有高度致癌風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，伊朗地區(qū)采集的玉米樣品中FB毒素的污染率達(dá)到53%［53］，巴西地區(qū)采集的玉米樣品中FB1的檢出率為100%［54］，F(xiàn)B毒素在不同地區(qū)、不同飼料作物上污染狀況略有差異，其污染狀況與各地區(qū)的氣候條件密切相關(guān)［55］。

2 飼用草產(chǎn)品中主要真菌毒素檢測(cè)分析方法

飼用草產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)是預(yù)防、控制和保障其質(zhì)量安全的必要手段。真菌毒素種類多樣，化學(xué)特性和作用機(jī)理各異，無(wú)法采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)完成對(duì)所有真菌毒素的定量測(cè)定。因此，準(zhǔn)確篩選、高效、快速的檢測(cè)方法是該領(lǐng)域當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。目前飼用草產(chǎn)品中真菌毒素主要的檢測(cè)方法分為以下7種。

2.1 熒光光度計(jì)法

熒光光度計(jì)法（fluorescence photometer method）通常結(jié)合免疫親和柱使用，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)須標(biāo)準(zhǔn)品、不與真菌毒素接觸、對(duì)人體危害較小、操作簡(jiǎn)單易上手、用時(shí)少［56］。缺點(diǎn)是不能多種毒素同時(shí)測(cè)定。熒光光度計(jì)法與高效液相色譜法具有很好的一致性，并且檢測(cè)限高于高效液相色譜法，完全可以達(dá)到篩選樣品和定量分析樣品的目的。王勇等［57］的研究結(jié)果表明免疫親和層析凈化熒光光度法可以快速檢測(cè)雞飼料中AF含量，回收率達(dá)85.8%～89.8%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠；裴道國(guó)等［58］的研究結(jié)果表明，免疫親和柱凈化-熒光光度法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)花生（Arachis hypogaea）及花生制品中AF含量，并對(duì)免疫親和柱凈化程序和熒光計(jì)性能進(jìn)行了優(yōu)化，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間和操作步驟，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度，使檢測(cè)效率大大提高。該方法可以高效、快速地分析測(cè)定單種真菌毒素的含量。

2.2 薄層色譜法

薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）是真菌毒素的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，將樣品中真菌毒素經(jīng)提取、洗脫、濃縮、薄層分離后，在特定波長(zhǎng)紫外燈下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行對(duì)照計(jì)算含量［59］。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行、抗干擾能力強(qiáng)且可重復(fù)多次檢測(cè)；不足是精確度相對(duì)較低，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性及再現(xiàn)性差，因此國(guó)際上采用此方法檢測(cè)真菌毒素的文章逐漸減少，不再作為一種檢測(cè)技術(shù)在新的學(xué)科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［60］。

2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是真菌毒素測(cè)定的常用方法［61］。該方法主要是通過(guò)有機(jī)溶劑將真菌毒素提取出來(lái)，然后利用免疫層析親和柱或多功能凈化柱凈化，再經(jīng)過(guò)衍生處理，最后上機(jī)利用熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析測(cè)定。常用的凈化柱為：C18柱、多功能凈化柱、活性A1203柱、免疫親和柱等［56］。HPLC樣品前處理方法的主要優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單、節(jié)省成本、重復(fù)性好等。Laura等［62］運(yùn)用HPLC技術(shù)檢測(cè)青貯飼料中AF含量，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該青貯飼料中含有AFB1、AFG1、AFB2和AFG2等4類；武倫瑋等［63］采用HPLC技術(shù)檢測(cè)飼料中的DON含量及其衍生物，多次重復(fù)檢測(cè)均能夠得到準(zhǔn)確的DON含量，說(shuō)明該方法具有較好的準(zhǔn)確性和精密度。目前，該方法廣泛用于飼料及飼料原料中真菌毒素的檢測(cè)分析。

2.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是通過(guò)液相色譜將樣品分離，進(jìn)入質(zhì)譜儀后被離子源電離，根據(jù)質(zhì)荷比、色譜圖的對(duì)比確定是何物質(zhì)。該方法具有靈敏度高、樣品制備簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、可以同時(shí)提供目標(biāo)化合物和保留時(shí)間、適合多組分一起分析等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)在飼料及飼料原料中關(guān)于AF的HPLC-MS測(cè)定方法逐漸增多。2016年，張養(yǎng)東等［64］利用LC-MS技術(shù)建立了青貯玉米中真菌毒素的檢測(cè)方法，研究結(jié)果表明4省市10個(gè)奶牛場(chǎng)全株青貯玉米樣品中真菌毒素含量由高到低依次為DON、ZEN、AFB2和麥角醇，檢測(cè)含量均未超過(guò)國(guó)家限量。符金華等［65］利用LC-MS技術(shù)對(duì)25種飼料及飼料原料樣品的16種真菌毒素進(jìn)行了檢測(cè)，提高了該技術(shù)在飼料及飼料原料中真菌毒素檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度；Zachariasova等［66］利用LC-MS技術(shù)對(duì)青貯樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出ZEN、DON、OTA、FB等真菌毒素。

2.5 氣相色譜法

氣相色譜法（gas chromatography，GC）是根據(jù)物質(zhì)的沸點(diǎn)和極性對(duì)化合物進(jìn)行分離分析。該方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、進(jìn)樣量小、檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)，是飼料和糧食中檢查真菌毒素的主要技術(shù)手段，可與電子捕獲檢測(cè)器、火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行聯(lián)用［67］，主要用于揮發(fā)性大、穩(wěn)定性好、分子中不含有發(fā)色基團(tuán)和熒光基團(tuán)的真菌毒素檢測(cè)，是ZEN、DON和鏈格孢毒素分析鑒定的常用方法［68］。

2.6 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）是將多組分的混合樣品通過(guò)色譜柱進(jìn)行分離、檢測(cè)和鑒定。該方法具有靈敏度高和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)學(xué)、化學(xué)和環(huán)境領(lǐng)域，為同時(shí)測(cè)定多種毒素提供了條件。梁穎等［69］建立了GC-MS技術(shù)測(cè)定飼料中DON的檢測(cè)方法，結(jié)果表明該方法檢測(cè)靈敏度高且重現(xiàn)性好，但也存在一定缺點(diǎn)，針對(duì)一些高穩(wěn)定性、難揮發(fā)特性的毒素，如鏈格孢霉菌素等，測(cè)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不好、易被基質(zhì)干擾［70］，會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；由于GC-MS測(cè)定方法對(duì)試驗(yàn)操作技術(shù)要求較高、耗材費(fèi)用昂貴、檢測(cè)樣品范圍較小，所以該方法很少用于飼料及飼料原料真菌毒素含量的檢測(cè)。

2.7 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）是目前在飼用草產(chǎn)品加工企業(yè)、大型飼料廠與養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)用最為廣泛的真菌毒素檢測(cè)方法，該方法快速、簡(jiǎn)單、靈敏且便于攜帶［71］。其缺點(diǎn)是測(cè)定需要昂貴儀器，若樣品成分較為復(fù)雜，其中的色素、重金屬離子、蛋白質(zhì)油脂等均會(huì)產(chǎn)生不同程度的非特異性干擾。Kocasari等［72］通過(guò)ELISA法對(duì)土耳其布爾杜爾省農(nóng)場(chǎng)的180份飼料樣品進(jìn)行真菌毒素的測(cè)定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DON、OTA、ZEN和T-2的污染率分別為48.3%、46.7%、31.7%和47.2%，說(shuō)明該方法可行。陳琛等［73］通過(guò)ELISA和HPLC-MS測(cè)定飼用玉米中的AFB1，研究結(jié)果表明，ELISA操作簡(jiǎn)單快速、效率較高，適用于飼用玉米中的AFB1的快速檢測(cè)；左麗［74］針對(duì)AFB1、DON、ZEN毒素對(duì)比了ELISA試劑盒和HPLC法測(cè)定結(jié)果，回收率最高的ELISA試劑盒測(cè)定配合飼料相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為20.7%，HPLC法則為6.42%，樣品ELISA法測(cè)定結(jié)果是HPLC法的1～10倍，說(shuō)明ELISA的準(zhǔn)確度低于HPLC法；李思齊等［75］采用ELISA法測(cè)定魯北地區(qū)全珠玉米青貯飼料，可以快速檢測(cè)出青貯飼料中DON、AFB1、ZEN、OTA、T-2等毒素，鑒于該方法快速便捷等優(yōu)勢(shì)，可以在養(yǎng)殖場(chǎng)及飼料加工廠大范圍推廣。

3 飼用草產(chǎn)品中主要真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)

為保障畜產(chǎn)品和人類健康，許多國(guó)家和國(guó)際組織均制定了飼料原料及相關(guān)飼料產(chǎn)品的限量標(biāo)準(zhǔn)［76-78］（表1），這些限量標(biāo)準(zhǔn)是非關(guān)稅壁壘的重要組成部分，也是我國(guó)畜產(chǎn)品安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要保障［18］。我國(guó)目前已制定了飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，但迄今為止我國(guó)和各地區(qū)尚未制定飼用草產(chǎn)品真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，只能參考糧食作物及飼料原料的限量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)執(zhí)行。

表1 部分國(guó)家和我國(guó)制定的飼料原料及飼料產(chǎn)品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The maximum limits of mycotoxins in feed ingredients and feed products by some countries and China

續(xù)表1 Continued Table 1

制定飼用草產(chǎn)品真菌毒素限量要求，是保護(hù)動(dòng)物家畜、畜產(chǎn)品及人類健康的必要措施，不僅起到規(guī)范飼用草產(chǎn)品生產(chǎn)和使用的作用，而且對(duì)飼用草產(chǎn)品的貿(mào)易流通也具有重要意義。雖然大多數(shù)國(guó)家已制定了大部分飼料及飼料原料真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)，但是尚未明確制定不同家畜飼用草產(chǎn)品真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)，因此制定符合各個(gè)國(guó)家和地區(qū)飼用草產(chǎn)品真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)是今后草牧業(yè)發(fā)展的重要舉措。

4 飼用草產(chǎn)品中主要真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

真菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估始于20世紀(jì)末［79］，首次開展農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作的是食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（Joint Expert Committee on Food Additives，JECFA），真菌毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估一般由危害識(shí)別、危害描述、暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)描述4個(gè)環(huán)節(jié)構(gòu)成，其中以暴露評(píng)估為關(guān)鍵步驟［80］。危害識(shí)別是描述真菌毒素引起動(dòng)物和人類不良影響的可能性，以及可能處于風(fēng)險(xiǎn)范圍內(nèi)的動(dòng)物和人類；危害描述是通過(guò)體內(nèi)或者體外試驗(yàn)對(duì)毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定什么條件下真菌毒素會(huì)對(duì)動(dòng)物或人類造成危害或引發(fā)疾病，確定危害物的健康指導(dǎo)值［81］；國(guó)內(nèi)外真菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要以膳食暴露方面的風(fēng)險(xiǎn)分析與評(píng)估為主，具體包括全膳食暴露的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［82］和不同人群攝入糧食產(chǎn)品中某種或者多種真菌毒素的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［83］，評(píng)價(jià)動(dòng)物或人類真菌毒素的攝入頻率、強(qiáng)度和時(shí)間［84］。風(fēng)險(xiǎn)描述是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的最后一步，是將危害識(shí)別、危害描述和暴露評(píng)估結(jié)合起來(lái)，根據(jù)定性或定量的評(píng)估來(lái)確定對(duì)動(dòng)物或者人類造成的潛在危害程度，為風(fēng)險(xiǎn)管理者提供科學(xué)建議。

我國(guó)糧油［85］、糧食和果蔬［86］方面均有完善的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。面對(duì)我國(guó)草產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，以及草畜一體化進(jìn)程加快的大好形勢(shì)，目前尚未建立和完善我國(guó)飼用草產(chǎn)品相關(guān)的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。真菌毒素作為飼用草產(chǎn)品最主要的安全風(fēng)險(xiǎn)因子之一，其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究在全國(guó)范圍內(nèi)受到關(guān)注，同時(shí)也引起科學(xué)家們的極大興趣。近年來(lái)，國(guó)家草業(yè)科技工作者在優(yōu)質(zhì)牧草的生產(chǎn)加工技術(shù)研發(fā)上投入大量精力，使我國(guó)牧草產(chǎn)量和品質(zhì)有了極大改善，但與國(guó)外相比仍有較大差距。當(dāng)前我國(guó)牧草產(chǎn)業(yè)仍存在生產(chǎn)規(guī)模小、市場(chǎng)機(jī)制不健全，質(zhì)量安全監(jiān)管力度差等問(wèn)題，形成了牧草產(chǎn)品以豆科牧草為主且品質(zhì)不高的局面。再加上大量的優(yōu)質(zhì)牧草產(chǎn)品在高效轉(zhuǎn)化利用方面仍存在諸多問(wèn)題，草畜耦合較差，導(dǎo)致生產(chǎn)的畜產(chǎn)品質(zhì)量偏低，營(yíng)養(yǎng)及安全指標(biāo)不達(dá)標(biāo)，所以飼用草產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也是增強(qiáng)我國(guó)草產(chǎn)業(yè)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的迫切需要。

5 飼用草產(chǎn)品中主要真菌毒素脫毒方法

飼用草產(chǎn)品在收獲、加工、調(diào)制、貯藏和運(yùn)輸中易發(fā)生霉變產(chǎn)生真菌毒素，造成飼料品質(zhì)劣變，家畜不喜采食，飼草大量浪費(fèi)，帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。如何有效地防控飼用草產(chǎn)品中真菌毒素的污染，是保障食草家畜安全和人類健康亟待解決的重要問(wèn)題。飼用草產(chǎn)品中常用的真菌毒素脫毒控制方法包括物理、化學(xué)和生物等方法［87］。

5.1 物理脫毒法

物理脫毒方法就是利用特殊的手段對(duì)毒素進(jìn)行調(diào)控和吸附，其機(jī)理就是較少毒素的滋生和吸附劑與毒素結(jié)合形成復(fù)合體，使毒素在經(jīng)過(guò)家畜消化道時(shí)不被吸收，從而減少毒素的危害［88］。劉鷹昊［89］的研究發(fā)現(xiàn)，不同加工方式對(duì)苜蓿草捆在貯藏期間內(nèi)真菌毒素含量影響顯著，含水量為17%，打捆密度為180 kg·m-3的苜蓿草捆在貯藏期間360 d內(nèi)真菌毒素的增加量最??；都帥等［90］研究發(fā)現(xiàn)，天然牧草高密度草捆中ZEN含量顯著低于低密度草捆。因此，適當(dāng)?shù)募庸し绞娇山档惋暡葜姓婢舅氐漠a(chǎn)生。飼用草產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中應(yīng)遵循先進(jìn)先出，高水分先出、低水分后出等原則，及時(shí)定期清理庫(kù)房，如有霉變，應(yīng)及時(shí)剔除，保證庫(kù)房干凈，減少真菌毒素的產(chǎn)生。受到真菌毒素污染后的飼用草產(chǎn)品，可通過(guò)添加吸附劑與霉菌毒素形成穩(wěn)定的毒素-吸附劑復(fù)合體，使毒素在經(jīng)過(guò)動(dòng)物腸道時(shí)不被動(dòng)物所吸收，減少動(dòng)物體內(nèi)毒素含量的積累［91］，是近年來(lái)被廣泛關(guān)注和重視的一種較為成熟的脫毒方法。常見的真菌毒素吸附劑主要有硅鋁酸鹽類、活性炭、有機(jī)聚合物3類［92］。Huwig等［93］研究發(fā)現(xiàn)飼料原料中添加鋁硅酸鹽或活性炭吸附劑可以明顯降低AFB1和FB含量。水合硅酸鈉鈣可以有效降低飼料中的T-2毒素［94］。此外還可以采用紫外照射法，將霉變飼料放置于陽(yáng)光下曬制，利用紫外線的作用，可有效破壞真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，降解飼料中的雜色曲霉菌毒素的污染。

5.2 化學(xué)脫毒法

化學(xué)脫毒方法即為通過(guò)殺菌劑、防腐劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或強(qiáng)氧化劑等化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制真菌和毒素生長(zhǎng)或消減［92］。將污染干草的水分含量提高到18%左右，置于25℃的環(huán)境中，用氨蒸氣處理14 d，然后再將干草干燥至含水量10%為宜，或者將發(fā)霉干草攤散在一張厚厚的聚乙烯薄膜上，將1.5%的氨水用霧化器慢慢噴灑均勻，可以有效去除其真菌毒素。

5.3 生物脫毒法

生物脫毒法就是利用微生物的生存競(jìng)爭(zhēng)作用和生物酶的降解作用，通過(guò)微生物和霉菌毒素產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和空間競(jìng)爭(zhēng)，影響霉菌毒素的正常繁殖，利用微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或酶與霉菌毒素結(jié)合形成毒素較小或無(wú)毒產(chǎn)物［95］。乳酸菌被廣泛用于發(fā)酵飼料的生產(chǎn)和加工來(lái)抑制霉菌毒素的產(chǎn)生［96］。Onilude等［97］的研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠很好地除去飼料青貯中的AF。尹曉燕等［98］研究發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合乳酸菌能夠降低發(fā)酵型全混合日糧發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)損失及真菌毒素的產(chǎn)生。Michálková［99］研究發(fā)現(xiàn)青貯添加劑甲酸可以有效降低苜蓿青貯飼料中的真菌毒素。Kim等［100］研究發(fā)現(xiàn)高水分玉米進(jìn)行青貯發(fā)酵時(shí)，添加乳酸菌劑有助于降低黃曲霉毒素的產(chǎn)生。張柏林等［101］認(rèn)為乳酸菌和真菌毒素競(jìng)爭(zhēng)的同時(shí)，不僅影響真菌毒素的正常生長(zhǎng)繁殖，還可以通過(guò)細(xì)胞壁與毒素結(jié)合，達(dá)到吸附和清除毒素的作用；Lglesias等［102］研究發(fā)現(xiàn)，布氏桿菌和植物乳桿菌可以有效降低全株玉米青貯飼料中黃曲霉毒素含量；崔彥召等［103］發(fā)現(xiàn)奶牛日糧中添加乳酸菌劑，能降低日糧中的DON含量，提高飼料適口性。大量的研究結(jié)果表明，利用生物技術(shù)方法脫毒是可行的；目前，常用微生物祛毒菌種包括：犁頭菌、黑曲霉、橙色黃桿菌等［104］。

6 展望

真菌毒素在飼用草產(chǎn)品中分布較廣，對(duì)家畜和人類健康存在不容忽視的潛在危害，逐漸引起世界各國(guó)的高度關(guān)注。飼用草產(chǎn)品作為家畜最重要的日糧來(lái)源之一，保證其質(zhì)量安全的重要性日益凸顯，準(zhǔn)確高效的檢測(cè)技術(shù)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和污染控制技術(shù)將成為日后飼用草產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。隨著國(guó)家對(duì)飼用草產(chǎn)品質(zhì)量安全科學(xué)研究的初步加強(qiáng)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的日益強(qiáng)化，中國(guó)對(duì)飼用草產(chǎn)品真菌毒素的研究也不斷深入，但與發(fā)達(dá)國(guó)家相比存在較大的差距，今后還需從以下幾個(gè)方面加強(qiáng)相關(guān)工作。第一，從飼用草產(chǎn)品中真菌毒素產(chǎn)生情況看，目前關(guān)注較多的是飼用草產(chǎn)品病原菌的識(shí)別和發(fā)生規(guī)律研究，各真菌毒素的產(chǎn)生機(jī)理尚不明確；第二，從飼用草產(chǎn)品真菌毒素的檢測(cè)技術(shù)來(lái)看，我國(guó)飼草產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)不完善，多集中在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)方面，快速的檢測(cè)方法與配套技術(shù)的研發(fā)尚不能滿足當(dāng)前的實(shí)際需求，提高飼用草產(chǎn)品真菌毒素的檢測(cè)能力是保障畜產(chǎn)品安全和人類健康的迫切需要，可能成為今后飼用草產(chǎn)品真菌毒素研究的熱點(diǎn)之一；第三，從飼用草產(chǎn)品的安全性角度來(lái)看，我國(guó)飼用草產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)體系不健全，現(xiàn)階段我國(guó)飼用草產(chǎn)品真菌毒素的限量規(guī)定僅依靠飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的飼料原料的限定形式體現(xiàn)，缺乏具體飼用草產(chǎn)品真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，逐步制定和完善符合我國(guó)飼用草產(chǎn)品真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)是今后的重要任務(wù)；第四，飼用草產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是我國(guó)草牧業(yè)高質(zhì)量、健康、可持續(xù)發(fā)展的必然要求，事關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展、草畜產(chǎn)品貿(mào)易、市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力、人體健康和安全及社會(huì)穩(wěn)定，若要保證草牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，急需開展飼用草產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并建立符合我國(guó)飼用草產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)來(lái)建立自動(dòng)化預(yù)警防控體系、實(shí)現(xiàn)飼用草產(chǎn)品真菌毒素的科學(xué)監(jiān)管是今后重要的研究?jī)?nèi)容。提高飼用草產(chǎn)品品質(zhì)、擴(kuò)大飼用草產(chǎn)品出口業(yè)務(wù)、使我國(guó)草資源優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為商品優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)、推動(dòng)我國(guó)草產(chǎn)業(yè)向境外發(fā)展。