慈興元，王艾俐，葉一鳴，徐思詩，王佳貝，潘依琦，陳俊，張麗芳，趙孔南

溫州醫(yī)科大學(xué)分子病毒與免疫學(xué)研究所，浙江溫州325035

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependen- tkinase 4，CDK4）為一類絲 ／ 蘇氨酸激酶，定位于染色體的12q13 區(qū)域［1］?？膳c細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）結(jié)合，導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（retinoblastomagene，pRB）磷酸化，使磷酸化的 pRB 與轉(zhuǎn)錄因子E2F發(fā)生分離，導(dǎo)致E2F 釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期轉(zhuǎn)向S 期，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程［2］。研究表明，CDK4 在多種腫瘤組織及癌細(xì)胞中存在過表達(dá)及活化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［3-4］，預(yù)示CDK4 可作為腫瘤生物治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)［5］。近年來，通過免疫動(dòng)物制備多克隆抗體，以代替價(jià)格昂貴的商業(yè)化抗體成為研究熱點(diǎn)。

本研究通過基因工程技術(shù)構(gòu)建CDK4 原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行原核表達(dá)及蛋白純化，利用重組蛋白免疫日本大耳白兔，制備抗CDK4 兔血清抗體，并鑒定其特異性。為進(jìn)一步研究CDK4 生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)［5］。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 CDK4 陽性人宮頸癌組織蠟塊由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供。本研究方案獲得該醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、菌株及載體 宮頸癌Siha 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；大腸埃希菌 BL21（DE3）菌株及pET21a（+）載體均購自美國Invitrogen 公司。

1.3 主要試劑及儀器 CDK4 商業(yè)化多克隆抗體購自美國CST 公司；HRP-羊抗兔IgG 抗體、兔源Histag 單克隆抗體-HRP 及 HRP-山羊抗鼠 IgG（H + L）均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；IPTG 購自上海杰瑞生物有限公司；鎳螯合親和層析膠購自德國Qiagen 公司；Hoechst 染料購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）均購自美國Gbico 公司；DAB 試劑盒及FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Hoechst 細(xì)胞核熒光染料、抗熒光猝滅劑及蘇木素均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ELx800 酶標(biāo)儀購自美國美國Bio-tect 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 潔凈級健康日本大耳白兔6 只，雌性，12 周齡，體重約 2 kg ／ 只，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：20190528Cezz0104020995。

1.5 CDK4 基因設(shè)計(jì)及合成 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫查找CDK4 序列，利用生物學(xué)軟件DNA star V7.1.0 選擇B 表位富集序列，并于兩端加入酶切位點(diǎn)（NdeⅠ和 XhoⅠ），經(jīng)密碼子優(yōu)化（http：／ ／ www.detaibio.com ／tools ／）后送北京擎科生物科技有限公司合成。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將合成的CDK4 序列克隆至pET21a（+）表達(dá)載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET21a（+）／CDK4。質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌 BL21（DE3）中，挑選單克隆，送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.7 重組蛋白的表達(dá)及純化 將鑒定正確的菌株接種至 LB 液體培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素 100 μg ／mL），37 ℃，250 r ／ min 培養(yǎng)過夜；次日進(jìn)行 50 倍擴(kuò)增，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h；加入終濃度 1.0 mmol ／ L 的 IPTG，37 ℃誘導(dǎo) 6 h；250 × g 離心 5 min，收集菌體；柱平衡液（pH 8.0）洗滌，超聲破碎，于 8 mol ／ L 尿素中溶解24 h；4 000 × g 離心 5 min，取上清，用鎳螯合親和層析柱進(jìn)行蛋白純化，分別用10 mL 的10、50、100、200 mmol ／ L 咪唑洗脫蛋白，并進(jìn)行 15% SDS-PAGE分析。

1.8 純化蛋白的鑒定 采用Western blot 法。純化的CDK4 重組蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)膜45 min；用含5%脫脂牛奶的TBST 室溫封閉2 h；加入兔源His-tag 單克隆抗體-HRP（用含5%脫脂牛奶的 TBST 1 ∶10 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌 5 次，5 min ／ 次；加入 HRP-山羊抗鼠 IgG（H + L）（用含 5%脫脂牛奶的 TBST 1 ∶10 000 稀釋），37 ℃搖床 2 h；TBST 洗滌 5 次，5 min ／ 次；化學(xué)發(fā)光顯影。洗脫蛋白經(jīng) 8 mol ／ L 尿素梯度透析，PBS 透析過夜后，于0 ℃冰中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 動(dòng)物免疫 日本大耳白兔6 只，隨機(jī)分為CDK4免疫組及PBS 對照組，每組3 只，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫，隔周1 次，共免疫3 次。首次免疫抗原與等量弗氏完全佐劑混合液，2、3 次免疫抗原與等量弗式不完全佐劑混合液；重組蛋白CDK4 免疫劑量為200 mg ／ 只，對照組免疫等劑量PBS。分別于末次免疫后 0（當(dāng)天）、2、4、6 及 8 周采集耳緣靜脈血，并于第8 周進(jìn)行心臟采血，分離血清，-80 ℃保存。

1.10 兔血清多克隆抗體效價(jià)的檢測 采用間接ELISA法。用 20 μg ／ mL 重組蛋白 CDK4 包被 96 孔酶標(biāo)板過夜；按不同周數(shù)及稀釋度（1 ∶40、1 ∶160、1 ∶640、1 ∶2 560、1 ∶10 240、1 ∶40 960、1 ∶163 840）加入CDK4 免疫組及 PBS 對照組兔血清，100 μL ／ 孔，每個(gè)血清設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，加入HRP-羊抗兔IgG 抗體（1 ∶5 000 稀釋），37 ℃孵育 1.5 h；TMB 顯色，酶標(biāo)儀檢測A450。

1.11 CDK4 兔血清抗體特異性的鑒定

1.11.1 免疫熒光法 在6 孔板中加入細(xì)胞爬片，用 Siha 細(xì)胞鋪板，4 × 105個(gè) ／ 孔，37 ℃培養(yǎng)過夜；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，37 ℃15 min；用0.3% Triton-X100 處理，37 ℃ 15 min；PBS 洗滌，加入 20% FBS封閉，37 ℃ 1 h；加入第 8 周的 CDK4 兔血清（1 ∶10 000稀釋），同時(shí)以PBS 對照組兔血清為陰性對照，CDK4商業(yè)化多克隆抗體為陽性對照，4 ℃過夜；PBST 洗滌，加入 FITC 標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1 ∶2 000 稀釋），37 ℃ 1 h；PBST 洗滌，Hoechst 染細(xì)胞核，抗熒光猝滅液封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照保存。

1.11.2 免疫組化試驗(yàn) 將臨床宮頸癌組織標(biāo)本脫蠟、水化，檸檬酸鹽抗原修復(fù)3 min；室溫自然冷卻，PBS 洗滌 3 次，5 min ／ 次；加入 CDK4 兔血清抗體（1 ∶5 000 稀釋），以 PBS 對照組兔血清為陰性對照，4 ℃ 14 h；加入酶標(biāo)羊抗鼠 ／ 兔 IgG 聚合物，37 ℃孵育 30 min；PBS 洗滌 5 次，5 min ／ 次；DAB 顯色1 min；蘇木素復(fù)染1 min；酒精梯度脫水；二甲苯通透15 min；中性樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照保存。以細(xì)胞胞核及胞漿呈棕黃色沉淀判定為陽性顯色反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pET21a（+）／CDK4的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見526 bp 的目的條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 重組質(zhì)粒 pET21a（+）／ CDK4 的雙酶切（NdeⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pET21a（+）／CDK4（NdeⅠ／ XhoⅠ）

2.2 純化產(chǎn)物的鑒定 純化產(chǎn)物經(jīng)15% SDS-PAGE分析，可見相對分子質(zhì)量約19 100 的單一蛋白條帶，大小與預(yù)期一致，見圖2。經(jīng)Western blot 分析，僅pET21a（+） ／ CDK4 ／ BL21（DE3）菌株能與 His-Tag單克隆抗體反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約19 100 處可見單一的蛋白條帶，見圖3。

2.2 CDK4 兔血清抗體效價(jià) 結(jié)果顯示，免疫組血清第2 周產(chǎn)生CDK4 特異性IgG 抗體，于第8 周血清效價(jià)達(dá)最高為 1 ∶163 840，見圖4。

圖2 重組蛋白CDK4 的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE profile of recombinant CDK4 protein

圖3 重組蛋白CDK4 的Western blot 分析Fig.3 Western blotting of recombinant CDK4 protein

圖4 CDK4 兔血清抗體產(chǎn)生時(shí)間（A）及效價(jià)（B）Fig.4 Time for appearance（A）and titer（B）of rabbit serum CDK4 antibody

2.3 CDK4 兔血清抗體的特異性

2.3.1 免疫熒光法 結(jié)果顯示，CDK4 血清抗體組及陽性對照組細(xì)胞核區(qū)域有藍(lán)色熒光，周邊區(qū)域?yàn)榫G色熒光，陰性對照組細(xì)胞核區(qū)域?yàn)樗{(lán)色熒光，周邊區(qū)域無綠色熒光，見圖5。表明制備的CDK4 抗體能識別Siha 細(xì)胞中天然表達(dá)的CDK4 蛋白。

圖5 CDK4 兔血清抗體特異性的免疫熒光鑒定（× 400）Fig.5 IFA of specificity of rabbit serum CDK4 antibody（× 400）

2.3.2 免疫組化試驗(yàn) 結(jié)果顯示，制備的兔血清抗體可與宮頸癌組織中的 CDK4 蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，呈陽性顯色反應(yīng)，而陰性對照組中未見棕黃色沉淀，呈陰性反應(yīng)，見圖6。表明制備的CDK4 兔血清抗體能識別宮頸癌組織中表達(dá)的CDK4 蛋白。

圖6 CDK4 兔血清抗體組（A）及陰性對照組（B）的免疫組化檢測（× 400）Fig.6 Immunohistochemical assay of CDK4 antibody in test（A）and control（B）groups（× 400）

3 討 論

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）家族有 CDKl ～ CDK7 等成員［6］。其中，CDK4 分子是 CDK 家族中重要的一員［6-7］，能使細(xì)胞從G1 期向S 期轉(zhuǎn)化，控制細(xì)胞的生長，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，即可驅(qū)動(dòng)DNA 的復(fù)制且具有引發(fā)細(xì)胞有絲分裂的雙重作用［8-10］。由于CDK4 在調(diào)控細(xì)胞周期過程中的重要作用，該基因有望用于腫瘤防治的靶標(biāo)研究。

2001 年，英國NURSE 及HUNT 分別發(fā)現(xiàn)了CDK和細(xì)胞周期蛋白（cyclin），為進(jìn)一步研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及早期診斷和治療提供了新思路［10-11］。周勛［12］通過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)NLS-AK 的MDAMB-231 細(xì)胞株，通過劃痕及Transwell 等試驗(yàn)分析，為胞內(nèi)CDK4 抗體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用提供了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，CDK4 是目前癌癥防治研究中的重要蛋白之一。

目前，單克隆抗體由于其純度高及特異性強(qiáng)，在腫瘤和感染的診斷及治療研究方面具有無可比擬的優(yōu)越性［13］。利用動(dòng)物免疫方法獲得的多克隆抗體制備技術(shù)簡單，成本較商業(yè)化抗體低廉，且所獲得的抗體具有效價(jià)高且特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可提高檢測的準(zhǔn)確度及靈敏度。因此，多克隆抗體在腫瘤及感染的診斷和治療研究方面也具有一定的應(yīng)用價(jià)值及應(yīng)用前景［14-15］。

本研究將人細(xì)胞中CDK4 基因，通過原核密碼子優(yōu)化后經(jīng)原核表達(dá)，制備了具有較強(qiáng)抗原性的重組蛋白CDK4，免疫日本大耳白兔后制備CDK4 特異性兔血清抗體，第8 周即可獲得高效價(jià)的兔血清抗體，效價(jià)達(dá)1：163 840。通過細(xì)胞免疫熒光及免疫組化試驗(yàn)鑒定，所制備的兔血清抗體具有能特異性識別天然CDK4 蛋白的特性。

本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備了重組蛋白CDK4 及其特異性的兔多克隆抗體，為CDK4 相關(guān)生物學(xué)及免疫學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。