吳菊， 王玲， 劉興容

西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科，四川 瀘州（646000）

齲病是常見的口腔細(xì)菌性疾病之一，不僅會(huì)影響患者咀嚼功能，還會(huì)影響患者言語(yǔ)、面部表情，甚至?xí)绊懟颊叩男睦斫】担??2］。研究表明，變異鏈球菌可通過黏附、產(chǎn)酸和耐酸作用破壞牙體組織而形成齲壞。黃芩是一種具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗菌等多種生物活性的中藥，可用于治療呼吸道感染、肺炎、結(jié)腸炎、肝炎和過敏性疾病［3］。黃芩苷（baicalin）是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要活性成分，僅在黃芩的根部黃芩苷的含量就可以達(dá)10.11%［4］。研究表明，黃芩能夠抑制痤瘡丙酸桿菌引起的白細(xì)胞介素?1β（interleukin?1β，IL?1β）和IL?8 水平的上調(diào)［5］；黃芩苷能夠抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成［6］。本文旨在探討黃芩苷對(duì)變異鏈球菌的抑菌作用；測(cè)定黃芩苷在體外環(huán)境中對(duì)變異鏈球菌UA159 的最低抑菌濃（minimum inhibitory concentration，MIC）；觀察不同濃度黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 生長(zhǎng)、黏附能力及生物膜形成的影響，為其在齲病防治中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與試劑

變異鏈球菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株UA159（以下簡(jiǎn)稱UA159）由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。BHI 瓊脂培養(yǎng)基、BHI 液體培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、黃芩苷、二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）、50%戊二醛（成都市科隆化學(xué)品有限公司，中國(guó)）、結(jié)晶紫染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）、一次性無菌接種環(huán)（Bilogix Group，美國(guó)）、Millex?GP 0.22 μm 微孔濾膜（Milli?pore 公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體倍比稀釋法測(cè)定UA159 的MIC 值 取10 支試管，編號(hào)1～10。1、2、8 號(hào)試管中加入1 mL黃芩苷藥液（濃度為48 mg/mL），2～7、9、10 試管中加入1 mL BHI液體培養(yǎng)基，1～7號(hào)管內(nèi)按二倍梯度稀釋，黃芩苷藥液濃度依次為48、24、12、6、3、1.5、0.75 mg/mL；第8 管為藥液對(duì)照組，藥液濃度為48 mg/mL；第9 管為溶劑對(duì)照組，藥液濃度為0 mg/mL；第10 管為菌液對(duì)照組，藥液濃度0 mg/mL。取凍存變異鏈球菌UA159 菌株，復(fù)蘇傳代，厭氧培養(yǎng)24 h；經(jīng)鏡檢確定為純培養(yǎng)后，取單個(gè)菌落接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、厭氧培養(yǎng)18 h；離心，無菌PBS 漂洗3 次；離心并用BHI 液體培養(yǎng)基稀釋重懸，調(diào)整菌液吸光度為OD600＝1.0；BHI液體培養(yǎng)基稀釋UA159菌懸液100倍后，加入到1～7號(hào)、9號(hào)及10號(hào)試管中；8 號(hào)試管中加入等體積的BHI 液體培養(yǎng)基。酶標(biāo)儀測(cè)37 ℃厭氧箱培養(yǎng)0、24 h 后各試管內(nèi)UA159 的OD600值，計(jì) 算24 h 后 的OD 增 長(zhǎng) 值，即ΔOD600值。每個(gè)濃度取樣3次，記錄數(shù)值取平均值。1.2.2 UA159 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取5 支試管，編號(hào)1～5。BHI 液體培養(yǎng)基分別稀釋黃芩苷藥物至MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 濃度，分別0.5 mL 加入1～4 號(hào)試管中；5 號(hào)試管為加入BHI 液體培養(yǎng)基0.5 mL 作為菌液對(duì)照組；5 支試管中均加入0.5mL BHI 液體培養(yǎng)基稀釋100 倍后的UA159 菌懸液。酶標(biāo)儀測(cè)37 ℃厭氧箱培養(yǎng)0、4、8、12、16、24 h 后各試管內(nèi)UA159 的OD600值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算OD600均值，繪制UA159 的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 不同濃度的黃芩苷對(duì)UA159 黏附能力影響 取5 支試管，編號(hào)1～5；將1%蔗糖BHI 液體培養(yǎng)基分別稀釋黃芩苷藥物至MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 濃度，分別加入1.5 mL 于1～4 號(hào)試管，5 號(hào)試管加入1%蔗糖BHI 液體培養(yǎng)基1.5 mL。5 支試管中各加入1.5 mL 稀釋100 倍后的菌懸液，將5 支試管傾斜30 °，置于37 ℃厭氧箱孵育18 h 后取出。孵育18 h 后，試管內(nèi)液體均倒入第二批相應(yīng)編號(hào)的試管中，原試管中各加入3 mL PBS 液。輕輕洗滌震蕩，將洗滌液移至第三批相應(yīng)編號(hào)的試管中，原試管中再次加入3 mL PBS 液，刮下原試管壁上的全部細(xì)菌。將第二、三批試管離心，棄上清液，再加入3 mL PBS 液。酶標(biāo)儀測(cè)定三批試管中UA159 的OD600值，取3 次。第一、二、三批試管內(nèi)OD600值分別對(duì)應(yīng)為X、Y、Z 值，計(jì)算細(xì)菌的黏附率及黏附抑制率；黏附率＝X/（X+Y+Z）×100%；黏附抑制率＝（菌液組黏附率?實(shí)驗(yàn)組黏附率）/菌液組黏附率×100%。

1.2.4 黃芩苷對(duì)UA159 生物膜形成量的影響 取96 孔板，1～5 號(hào)孔中分別加入100 μL BHI 液體培養(yǎng)基稀釋100 倍后的UA159 菌懸液，每孔設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。厭氧培養(yǎng)24 h，在第0 h、6 h、12 h，分別在1～3 號(hào)及復(fù)孔中加入100 μL 含20 mg/mL 的黃芩苷藥液的BHI 液體培養(yǎng)基。設(shè)置4 號(hào)溶劑對(duì)照組和5 號(hào)菌液對(duì)照組。24 h 后取出孔板，吸棄培養(yǎng)液，無菌PBS 緩沖漂洗3 次，干燥，甲醛固定；洗去甲醛，每孔加入1%結(jié)晶紫染色液200 μL，靜置5 min 吸出，PBS 緩沖液漂洗3 次，室溫干燥。每孔加入33%冰乙酸溶液200 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用30 min 后，酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值以評(píng)估生物膜的形成的量。

1.2.5 掃 描 電 鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察黃芩苷對(duì)UA159 細(xì)菌總量的影響 重復(fù)1.2.4 方法稀釋UA159 菌液，取2 個(gè)一次性無菌6 孔板，其中10 個(gè)孔中均置入22 mm×22 mm 無菌蓋玻片，加入菌液1 mL，分5 組，每組2 孔，厭氧培養(yǎng)24 h，在第0、6、12 h 這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別在1、2、3 組的每個(gè)孔中加入1 mL 20 mg/mL 的黃芩苷藥液，使得最終黃芩苷藥液濃度為10 mg/mL。設(shè)置溶劑對(duì)照組和菌液對(duì)照組。取出6 孔板，吸干菌液，無菌PBS 溶液漂洗，吸棄；加入2 mL 的2.5%戊二醛溶液，加蓋放入4 ℃冰箱中固定4 h；吸棄孔內(nèi)戊二醛溶液，無菌PBS 溶液漂洗，PBS 緩沖液漂洗2 次；依次用50%、70%、80%、90%酒精梯度脫水，無水乙醇脫水2 次，室溫干燥。每組選取1 枚化蓋玻片CO2臨界點(diǎn)干燥粘臺(tái)，噴金。SEM 下觀察，拍照存圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采取SPSS Statistics20.0 進(jìn)行分析，定量資料采用±s表示。組間比較采用單因素方差分析；Lev?en 檢驗(yàn)方差齊性，方差齊性采用LSD 法分析；方差不齊采用Dunnett's 法分析；P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷對(duì)UA159 的MIC 值

試管1、2 號(hào)表現(xiàn)為清亮無渾濁沉淀生長(zhǎng)的淡黃色液體，而試管3～7 號(hào)、9 號(hào)與10 號(hào)表現(xiàn)為淡黃色渾濁液體或有沉淀。ΔOD600值結(jié)果見表1，經(jīng)過單因素方差分析，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2435.346，P＜0.05），根據(jù)結(jié)果所示，結(jié)合以肉眼觀察試管內(nèi)液體清亮無渾濁或沉淀的最低藥物濃度為黃芩苷的MIC，測(cè)得黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159的MIC 值為12 mg/mL。

表1 變異鏈球菌UA159 在不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 1 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different baicalin concentrations ±s，n＝3

表1 變異鏈球菌UA159 在不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 1 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different baicalin concentrations ±s，n＝3

P value:compared with tube 10(bacteria control group)

Tube numer P 123456789 Baicalin concentration（mg/mL）24 12 63 1.5 0.75 0.375 24 10 00 ΔOD600值0.046±0.007 0.094±0.001 0.182±0.004 0.265±0.002 0.377±0.003 0.377±0.005 0.378±0.008 0.020±0.005 0.377±0.007 0.380±0.005＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.406 0.544 0.595＜0.001 0.496-

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由2.1 結(jié)果已知MIC 為黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159的MIC值為12 mg/mL，則設(shè)置MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 濃度分別為12、6、3、1.5 mg/mL。變異鏈球菌UA159的生長(zhǎng)速度隨著黃芩苷藥液濃度的增加而變慢。在0～12 h內(nèi)菌液組增長(zhǎng)迅速，后速度變緩，進(jìn)入穩(wěn)定期；1.5 mg/mL 藥液組與菌液對(duì)照組相比在0 h、4 h時(shí)OD600值較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），12、6、3 mg/mL 三組與菌液對(duì)照組（0 mg/mL）各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，OD600值均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），不同黃芩苷濃度組組間相互比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2、圖1。

2.3 黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 黏附的影響

變異鏈球菌UA159 在37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h 后黏附率為42.33%；隨著黃芩苷藥液組濃度的增加，變異鏈球菌UA159 黏附率下降；經(jīng)單因素方差分析，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝760.401，P＜0.05）；各濃度組與菌液對(duì)照組組（0 mg/mL）相比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)黏附率計(jì)算得出各組的黏附抑制率顯示：隨著黃芩苷藥液濃度的增加黏附抑制率在增加，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝667.282，P＜0.05）。且各組間兩兩比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2 變異鏈球菌UA159 在不同時(shí)間點(diǎn)不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 2 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different concentrations of baicalin at different time points ±s，n＝3

表2 變異鏈球菌UA159 在不同時(shí)間點(diǎn)不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 2 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different concentrations of baicalin at different time points ±s，n＝3

P1: 12 mg/mL group vs. 0 mg/mL group; P2: 6 mg/mL group vs. 0 mg/mL group; P3: 3 mg/mL group vs. 0 mg/mL group; P4: 1.5 mg/mL group vs. 0 mg/mL group

Time（h）Baicalin concentration P F 12 mg/mL 0.123±0.002 0.174±0.005 0.211±0.005 0.277±0.003 6 mg/mL 0.152±0.002 0.236±0.008 0.315±0.009 0.327±0.003 3 mg/mL 0.184±0.004 0.311±0.005 0.411±0.003 0.452±0.005 1.5 mg/mL 0.192±0.003 0.375±0.003 0.458±0.004 0.466±0.003 0 mg/mL 0.211±0.004 0.380±0.002 0.466±0.003 0.473±0.002 P1 P2 P3 P4 48 12 24 349.182 895.601 1 180.943 2 197.682＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.246 0.103 0.068

Figure 1 Growth curves of Streptococcus mutans UA159 at different concentrations of baicalin圖1 變異鏈球菌UA159 在不同黃芩苷濃度下的生長(zhǎng)曲線

表3 不同黃芩苷濃度對(duì)變異鏈球菌UA159 黏附的影響Table 3 Effects of different concentrations of baicalin on adhesion of Streptococcus mutans UA159±s，n＝3

表3 不同黃芩苷濃度對(duì)變異鏈球菌UA159 黏附的影響Table 3 Effects of different concentrations of baicalin on adhesion of Streptococcus mutans UA159±s，n＝3

*：compared with 0 mg/mL group，P＜0.05；△：group comparison，P＜0.05

Baicalin concentration 12 mg/mL 6 mg/mL 3 mg/mL 1.5 mg/mL 0 mg/mL Adhesion rate（%）28.00±0.36*31.13±0.47*33.06±0.20*35.47±0.40*42.32±0.45 Adhesion inhibition rate（%）33.83±0.92△25.77±2.18△22.18±0.69△16.18±0.71△0

2.4 黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 的生物膜形成的影響

黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 生物膜形成量的影響結(jié)果見表4，經(jīng)單因素方差分析，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝958.613，P＜0.05）。與菌液組相比，0、6、12 h 時(shí)加入黃芩苷藥液干預(yù)變異鏈球菌生物膜形成的差異是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的（P＜0.001），而溶劑組細(xì)菌生物膜形成的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.304）。

表4 黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 的生物膜形成量的影響Table 4 Effects of baicalin on biofilm formation of Streptococcus mutans UA159 ±s，n＝3

表4 黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 的生物膜形成量的影響Table 4 Effects of baicalin on biofilm formation of Streptococcus mutans UA159 ±s，n＝3

P value:compared with bacteria control group

Group 0 h 6 h 12 h Solvent control Bacteria control OD600 0.132±0.003 0.247±0.007 0.288±0.006 0.376±0.004 0.381±0.007 P＜0.000＜0.000＜0.000 0.304-

2.5 SEM 觀察黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 細(xì)菌總量的影響

SEM 下觀察菌株背景為灰黑色，細(xì)菌菌體為亮白色，圓形。變異鏈球菌UA159 培養(yǎng)24 h 后生長(zhǎng)良好（圖2a、2b）。0 h 加入黃芩苷后UA159 菌體均基本以成對(duì)狀（圖2c、2d）；6 h 加入黃芩苷后細(xì)菌總量明顯下降（圖2e、2f）；12 h 時(shí)加入黃芩苷后細(xì)菌總量明顯下降（圖2g、2h）。溶劑對(duì)照組（圖2i、2j）與菌液對(duì)照組相比，無明顯差異。

3 討 論

牙菌斑的形成與發(fā)育需要多種細(xì)菌的參與，變異鏈球菌血清型c、e、f 是已知的致齲菌［8?9］。變異鏈球菌通過使牙體硬組織脫礦導(dǎo)致齲齒形成［10］。目前臨床上常用的防齲方法有氟化物防齲、氯己定防齲等。研究表明，氟化物雖然對(duì)變異鏈球菌生物膜具有抗酸作用，但短暫的氟化物處理不能維持對(duì)生物膜中的變形鏈球菌的抗酸活性，生物膜的損害可以隨著時(shí)間的推移而恢復(fù)［11］。氟化物的濫用易導(dǎo)致耐氟菌株的出現(xiàn)，過量使用會(huì)導(dǎo)致人體氟中毒，出現(xiàn)氟骨癥、氟斑牙等。天然藥物具有毒副作用小、不易造成菌群失調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，已有研究發(fā)現(xiàn)，黃柏、肉桂、丁香、金針菇提取物等天然藥物對(duì)變異鏈球菌都有抑制作用［12?14］。黃芩苷作為一種天然的抑菌藥物，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃芩苷與變異鏈球菌致齲性研究比較少見。

Figure 2 Effects of baicalin on the total number of Streptococcus mutans UA159 bacteria was observed under SEM圖2 掃描電鏡下觀察黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 細(xì)菌總量的影響

3.1 黃芩苷對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)采用液體二倍稀釋法結(jié)合酶標(biāo)儀測(cè)定天然藥物黃芩苷對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的作用，結(jié)果顯示黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 的MIC 值為12 mg/mL。在生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，把變異鏈球菌UA159 添加到質(zhì)量濃度為12、6、3、1.5 mg/mL 的黃芩苷及無藥液的BHI 培養(yǎng)基內(nèi)，從不同時(shí)間點(diǎn)的OD600值看出，加入黃芩苷的變異鏈球菌UA159 與標(biāo)準(zhǔn)變異鏈球菌UA159 生長(zhǎng)趨勢(shì)上基本一致，但菌液濃度均低于標(biāo)準(zhǔn)變異鏈球菌UA159 組，推測(cè)其原因可能是黃芩苷可能并不影響變異鏈球菌UA159 生長(zhǎng)的基本趨勢(shì)，但會(huì)影響變異鏈球菌UA159 增殖速度。

3.2 黃芩苷對(duì)變異鏈球菌黏附的影響

黏附是細(xì)菌在宿主內(nèi)定居的第一步，變異鏈球菌對(duì)牙面的黏附是其定植、致齲的基礎(chǔ)。變形鏈球菌菌株產(chǎn)生三種葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyl trans?ferase，GTF），包括GTF?B、GTF?C 和GTF?D，它們利用蔗糖作為底物來合成葡聚糖；變異鏈球菌還具有多種高親和力表面粘附素，即使在沒有蔗糖的情況下也能夠定植［15］。黏附素在變異鏈球菌與基質(zhì)的黏附中發(fā)揮重要作用，黏附素包含葡糖基轉(zhuǎn)移酶、葡聚糖結(jié)合蛋白、變異鏈球菌表面蛋白P1等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，變異鏈球菌UA159 在37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h 后黏附率為42.33%；隨著黃芩苷藥液組濃度的增加，變異鏈球菌UA159 黏附率下降，對(duì)細(xì)菌的黏附抑制率在增加；表明黃芩苷具有抑制變異鏈球菌黏附的作用。黃芩苷抑制變異鏈球菌黏附的具體抑制機(jī)制尚不清楚，可能與黏附相關(guān)因子或者黏附相關(guān)基因有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.3 黃芩苷對(duì)變異鏈球菌生物膜形成及細(xì)菌總量的影響

口腔內(nèi)牙菌斑形成過程比較復(fù)雜，以下三階段：獲得性膜形成階段、細(xì)菌附著階段、菌斑成熟階段，細(xì)菌表面的受體可在獲得性膜形成后，與之結(jié)合，可共同抵抗有滲透作用的藥物，同時(shí)還可加強(qiáng)其他微生物對(duì)牙釉質(zhì)的黏附作用［16］。變異鏈球菌分泌的胞外多糖，容易與結(jié)晶紫結(jié)合，胞外多糖與結(jié)晶紫的結(jié)合物在600 nm 波長(zhǎng)下有最大吸收，因此，為了反映生物膜的生成量，本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)儀在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值，OD 值越小表示生物膜的生成量越小，即藥物對(duì)生物膜的抑制作用越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在0、6、12 h 時(shí)加入黃芩苷藥液均可影響變異鏈球菌UA159 生物膜形成的量，DMSO 溶液不會(huì)影響細(xì)菌生物膜形成的量，說明黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 生物膜形成有很好的抑制效果。

電子顯微鏡顯著優(yōu)于光學(xué)顯微鏡的一大特點(diǎn)是它的高分辨率，目前超高分辨率掃描電鏡分辨率高達(dá)0.4 nm。本實(shí)驗(yàn)通過SEM 觀察到10 mg/mL的黃芩苷在0、6、12 h 時(shí)加入均可影響UA159 在體外蓋玻片上形成的細(xì)菌總量的密度，表明在變異鏈球菌UA159 形成的不同時(shí)期加入黃苓苷均使細(xì)菌總量顯著減少。

4 小 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過天然藥物黃芩苷對(duì)致齲菌變異鏈球菌在體外環(huán)境中進(jìn)行研究，得出以下結(jié)論：①黃芩苷對(duì)變異鏈球菌UA159 的MIIC 值為12 mg/mL；②黃芩苷并不影響變異鏈球菌基本的生長(zhǎng)趨勢(shì)，但會(huì)降低其生長(zhǎng)增殖的速度；③黃芩苷可以抑制變異鏈球菌的黏附，但并不能完全使變異鏈球菌喪失黏附能力；④黃芩苷可以減緩變異鏈球菌細(xì)菌生物膜的形成速度，但不能完全阻斷細(xì)菌生物膜的形成；⑤黃苓苷對(duì)變異鏈球菌形成的不同時(shí)期均有抑制作用。

【Author contributions】Wu J performed the experiments and wrote the article. Wang L collected the data. Liu XR designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.