史慧芹，肖 麓

(青海大學(xué)，青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海省春油菜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家油菜改良中心，青海分中心農(nóng)業(yè)部春油菜科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海省春油菜研究開發(fā)中心，青海 西寧 810016)

油菜是中國(guó)重要的油料作物，是油脂、蛋白質(zhì)飼料及工業(yè)原料來源之一，具有生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)、用途廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)[1]。由于油菜栽培方式的變化與除草劑的廣泛使用，導(dǎo)致油菜田間雜草問題日趨嚴(yán)重[2]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)每年有50%～80%的油菜種植面積發(fā)生雜草危害，可造成15%～20%的產(chǎn)量損失[3]。田間除草方式分為勞動(dòng)力成本高的人工中耕除草和快速高效防控草害的化學(xué)除草劑除草[4]。但由于種植田經(jīng)常出現(xiàn)單子葉與雙子葉類雜草混生，對(duì)除草劑的劑量及噴施時(shí)間的把控要求嚴(yán)格，難以達(dá)到預(yù)期的除草效果，導(dǎo)致全世界的農(nóng)作物每年減產(chǎn)10%左右[5]。因此，對(duì)抗廣譜性除草劑油菜品種的培育有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，草甘膦(Glyphosate，N-磷酸基甲基甘氨酸)是滅生型除草劑之一[6]，具有高效、低毒、低殘留、無污染以及雜草不易產(chǎn)生抗性的特點(diǎn)，且不影響后茬作物生長(zhǎng)等優(yōu)良性能[7]。閆睿智等[8]以抗草甘膦品系RH和3份恢復(fù)系6275、7-5、5200R為親本材料進(jìn)行一次雜交、三次回交、兩次自交和兩次背景選擇，使得雜交種獲得抗除草劑特性。周心童等[9]利用一年多代回交轉(zhuǎn)育技術(shù)，將EPSPS基因轉(zhuǎn)入5個(gè)常規(guī)親本中，從而獲得穩(wěn)定的含有抗性基因的新品系材料。利用一年多代快速回交轉(zhuǎn)育技術(shù)向轉(zhuǎn)EPSPS基因油菜新品種進(jìn)行的選育，如果配合草甘膦共同使用，有助于遏制雜草危害、降低環(huán)境污染，表現(xiàn)出經(jīng)濟(jì)性、環(huán)境友好性的優(yōu)點(diǎn)，可為抗草甘膦油菜新品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體親本 以含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因的油菜品系甲HX6作為供體親本(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)。

1.1.2 輪回親本 選用青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院春油菜所提供的兩份優(yōu)良的甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系(1704、3660)作為輪回親本。其中1704為特早熟春性甘藍(lán)型油菜品系，3660為特晚熟春性甘藍(lán)型油菜品系，兩份材料均為非轉(zhuǎn)基因材料。

1.2 雜交及回交方法

2018年6月，采用甲HX6與1704、3660分別進(jìn)行雜交，獲得F1。2019年1月，將F1分別與各自的輪回親本進(jìn)行回交，得到BC1F1世代。2019年采用目標(biāo)基因特異性引物分析BC1F1群體，選擇在目標(biāo)位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合型且遺傳背景與輪回親本相似度高的單株繼續(xù)與1704、3660進(jìn)行回交，獲得BC2F1世代。2020年采用相同的方法獲得BC3F1世代。

1.3 DNA提取及除草劑抗性基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

采用CTAB法[10]提取親本以及春性甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)育后代的葉片基因組DNA。參考文獻(xiàn)[11]方法檢測(cè)抗性基因I.variabilis-EPSPS*。該引物用于檢測(cè)油菜轉(zhuǎn)化體的特異性，將其命名為MEPSPS。上游引物序列：5′-ATACGCTCCCACATCCTGTC-3′，下游引物序列：5′-ATTAGCGCTAGGGACGTGAG-3′。

滑動(dòng)網(wǎng)格方法是對(duì)邊界修正方法的一個(gè)補(bǔ)充，改進(jìn)算法對(duì)稠密區(qū)域進(jìn)行邊界修正，僅僅確定了聚類的邊界，而對(duì)于沒有相鄰稠密單元的低密度網(wǎng)格單元，其中的數(shù)據(jù)點(diǎn)會(huì)被作為孤立點(diǎn)處理，使得聚類的準(zhǔn)確性降低。該方法采用滑動(dòng)網(wǎng)格的思想，搜索沒有鄰近稠密網(wǎng)格的稀疏網(wǎng)格單元，對(duì)可以組成田字格的網(wǎng)格單元做進(jìn)一步劃分，將新劃分的網(wǎng)格沿特定方向滑動(dòng)，盡可能尋回稀疏區(qū)域的稠密網(wǎng)格。具體方法為計(jì)算各網(wǎng)格的矢量坐標(biāo)以及網(wǎng)格滑動(dòng)的方向矢量其中c為0田字格中所有網(wǎng)格的公共頂點(diǎn)，gi為網(wǎng)格ui的重心，計(jì)算公式如下：

針對(duì)這些不可避免的自然因素對(duì)檔案的影響，就要建立起以預(yù)防為主，修繕為輔的檔案保護(hù)模式，應(yīng)建立起專門的檔案庫(kù)房館并使用相關(guān)的合理設(shè)備。該館的溫度、濕度等都要符合檔案的保存條件，而且該館在建造時(shí)，應(yīng)采用節(jié)能、環(huán)保的材料，要重點(diǎn)注意庫(kù)房的防火、防水，防空氣污染、防有害生物等情況，從而建立一個(gè)良好的檔案保存環(huán)境。對(duì)電子檔案來說，要以預(yù)防信息泄露和保障信息安全為主，建立起覆蓋各層次的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境。同時(shí)，要對(duì)毀壞性的檔案進(jìn)行修補(bǔ)，包括檔案去污和對(duì)檔案館進(jìn)行驅(qū)蟲滅菌等，合理的檔案預(yù)防和修補(bǔ)技術(shù)能有效保護(hù)檔案的安全。

PCR體系：0.25 mmol/L 10×Buffer 2μL，2 mmol/L dNTPs 1.6 μL，1UTaq酶 0.2 μL，0.5 mol/L上、下游引物各1 μL，60 ng模板DNA 2 μL，加ddH2O至20 μL。循環(huán)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)共34組；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，無毒核酸染料(4s Red Plus Nucleic Acid Stain)染色，在凝膠圖像成像儀(Universal Hood Ⅱ)觀察照相。

1.4 除草劑的抗性檢測(cè)

對(duì)上述3份親本材料進(jìn)行PCR驗(yàn)證后，將抗性單株甲HX6與春性甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系(1704和3660)進(jìn)行雜交，再回交轉(zhuǎn)育獲得BC3F1代。在傳代進(jìn)程中，分別對(duì)不同世代的材料進(jìn)行分子標(biāo)記輔助試樣，選擇篩選出含有抗性基因的單株(圖2)，保證抗性基因在傳代進(jìn)程中不會(huì)丟失。

綜上所述,對(duì)玻璃體視網(wǎng)膜疾病患者實(shí)施玻璃體切除術(shù)有利于促進(jìn)傷口愈合,視力恢復(fù),臨床效果理想,值得臨床應(yīng)用與推廣。

1.5 遺傳背景檢測(cè)

取親本及各BC世代的轉(zhuǎn)基因回交材料約2 cm2大小的嫩葉送至武漢基諾賽克公司進(jìn)行遺傳背景分析。遺傳背景回復(fù)率的計(jì)算[12]公式：G(g)=[L+X(g)]/(2L)=1/2+(1/2)(X(g)/L)， 式中：G(g)代表g代遺傳背景回復(fù)率；X(g)指回交g代表現(xiàn)為輪回親本帶型分子標(biāo)記數(shù)量；L指選擇條件下所采用所有分子標(biāo)記數(shù)量，計(jì)算時(shí)假設(shè)各標(biāo)記位點(diǎn)間獨(dú)立。

2 結(jié)果與分析

2.1 I.variabilis-EPSPS*抗性基因的PCR鑒定

BC1_3660共培育成苗80株，對(duì)其全部展開背景回復(fù)率檢測(cè)(表3)，群體背景回復(fù)率51.16%～86.36%，均值75.24%(>75%)，單株遺傳背景和輪回親本最高相似度達(dá)86.36%。以同樣的方法獲得BC2F1代、BC3F1代(背景回復(fù)率正在進(jìn)行測(cè)試)。

在人工氣候室內(nèi)待油菜長(zhǎng)出5～6片真葉時(shí)，采用小型手動(dòng)噴霧器噴施1次90 mg/L 41%農(nóng)達(dá)異丙胺鹽制劑，保證每單株用藥量在3 mL左右。在噴施處理前、后的1～4周內(nèi)觀察并調(diào)查其抗性。

2.2 噴藥篩選抗性材料

為了快速得到背景回復(fù)率結(jié)果，將BC1_1704和BC1_3660所有材料的葉片送至武漢基諾塞克公司進(jìn)行背景回復(fù)率分析。BC1_1704共成苗70株，群體背景回復(fù)率62.00%～83.82%，平均背景回復(fù)率72.27%(<75%)。由表2可知，部分單株的背景回復(fù)率達(dá)到75%的標(biāo)準(zhǔn)，但往往還是有部分不滿足此標(biāo)準(zhǔn)，回交群體回復(fù)為輪回親本基因型往往會(huì)出現(xiàn)一些偏離。結(jié)合前面PCR抗性基因檢測(cè)結(jié)果，選擇背景回復(fù)率高的5個(gè)單株進(jìn)一步與輪回親本回交獲得BC2F1代。由于背景回復(fù)率試驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，先對(duì)BC2F1代進(jìn)行前景選擇，選擇含有抗性基因且生長(zhǎng)勢(shì)較好的單株與輪回親本1704品系進(jìn)行回交獲得BC3F1代(背景回復(fù)率正在進(jìn)行測(cè)試)。

2.3 背景分析

提取BC1F1群體DNA，展開背景回復(fù)率分析?；诿總€(gè)位點(diǎn)的測(cè)序數(shù)據(jù)，分析各目標(biāo)位點(diǎn)的基因型，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，群體中需要檢測(cè)的基因型共有33 790個(gè)，最終獲得了有效數(shù)據(jù)(Depth≥30)的基因型比例為94.55%，平均測(cè)序深度為4 011.70倍。

表1 目標(biāo)位點(diǎn)在部分樣品中的測(cè)序深度統(tǒng)計(jì)表

運(yùn)用90 mg/L 草甘膦溶液，單株受藥量3 mL，對(duì)回交后代予以充分噴藥，對(duì)植株進(jìn)行抗藥性觀察，發(fā)現(xiàn)7～9 d后，不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因的單株出現(xiàn)中心葉片顏色泛黃，并逐漸外擴(kuò)，15～20 d 后整株死亡。含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因單株不受影響，生長(zhǎng)良好。以1704為輪回親本所獲得的BC1F1代(簡(jiǎn)稱BC1_1704)共培育出70株，待成株后全面噴施除草劑，20 d后清點(diǎn)成活率，發(fā)現(xiàn)共30個(gè)單株成活，占比42.86%。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單株均含I.variabilis-EPSPS*抗性基因；其余40個(gè)單株全部死亡，經(jīng)檢測(cè)這些單株均不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因；以1704為輪回親本獲得的BC2F1代(之后稱為BC2_1704)共成苗50株，其中32株正常存活，經(jīng)檢測(cè)這些單株均含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因，其余單株死亡。以3660品系為輪回親本獲得的BC1F1代(之后稱為BC1_3660)共成苗80株，除草劑噴施后46株(57.5%)能夠正常存活，在3660品系，含有抗性基因的單株共46株，經(jīng)檢測(cè)這些單株均含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因；以3660品系為輪回親本獲得的BC2F1代(之后稱為BC2_3660)成苗60株，噴施除草劑后有15株生長(zhǎng)正常；檢測(cè)死去單株，發(fā)現(xiàn)均不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因(圖3)。

表2 BC1_1704背景回復(fù)率統(tǒng)計(jì)表

選用目標(biāo)基因特異性引物對(duì)本研究中采用的3份親本材料進(jìn)行擴(kuò)增，甲HX6中擴(kuò)增得到了片段大小為732 bp的目標(biāo)片段；而特早熟(1704)與特晚熟(3660)甘藍(lán)型油菜中均未擴(kuò)增出732 bp的目標(biāo)條帶(圖1)。經(jīng)過分析表明，I.variabilis-EPSPS*基因已成功轉(zhuǎn)入甲HX6品系中。

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所副所長(zhǎng)張玉鑫介紹說，武威地區(qū)全年降水量102-200毫米，蒸發(fā)量卻在2000毫米以上，這是其土壤嚴(yán)重干旱缺水的重要原因。十幾年來，在當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)部門的大力支持引導(dǎo)下，設(shè)施農(nóng)業(yè)蓬勃發(fā)展，尤其是依托當(dāng)?shù)厝照召Y源發(fā)展的日光大棚，為農(nóng)戶帶來了可觀的收入，此時(shí)的大漠已是欣欣向榮。據(jù)統(tǒng)計(jì)，武威日光溫室和塑料大棚面積已達(dá)到17.2萬畝，其中，日光溫室就占到了14.1萬畝，是甘肅重要的蔬菜產(chǎn)區(qū)。但同我國(guó)其他省份一樣，由于多年來肥料的不合理使用，武威地區(qū)土壤板結(jié)嚴(yán)重，瓜果蔬菜品質(zhì)逐年下降，農(nóng)戶們看在眼里，急在心上。

表3 BC1_3660背景回復(fù)率統(tǒng)計(jì)表

表3(續(xù))

3 討論與結(jié)論

(1)目前，I.variabilis-EPSPS*基因是控制油菜草甘膦抗性的一個(gè)重要基因?？共莞熟⒂筒耸侵袊?guó)推廣范圍最廣的一類抗性油菜品種，但由于我國(guó)尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因油菜的種植，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因作物種質(zhì)資源匱乏，近年來對(duì)抗性作物的轉(zhuǎn)育已成為重要的研究目標(biāo)[14-15]。而雜交轉(zhuǎn)育是作物遺傳育種的基本方法，可以利用不同的親本配制雜交組合，在分離后代中定向選育，獲得不同性狀聚合的新品種[16]。本研究利用李杰華等[17]所提供的甲HX6含I.variabilis-EPSPS*抗性基因的單株，與特早熟與特晚熟甘藍(lán)型油菜品系1704、3660進(jìn)行雜交轉(zhuǎn)育，最終獲得含有抗性基因的特早熟與特晚熟春性甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系。

4.2 各地年降水量在20世紀(jì)60年代中期和80年代末出現(xiàn)異常偏多，夏季降水量異常對(duì)全年降水異常的貢獻(xiàn)最大。

(2)草甘膦是通過莖葉傳導(dǎo)組織傳遞至植物全株，促進(jìn)雜草死亡的一類內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑。但在植物幼嫩期無效，這是由于幼嫩期葉面小、運(yùn)輸組織不發(fā)達(dá)。生長(zhǎng)旺盛的植物其傳導(dǎo)組織完善，葉面積較大，利用草甘膦能達(dá)到顯著的除草效果[1]。根據(jù)柳寒等[1]對(duì)擬南芥苗期、苔期抗性研究結(jié)果顯示，草甘膦直接噴至植物生殖器官，阻礙其發(fā)育。為有效發(fā)揮除草劑的作用，就要求選對(duì)噴灑時(shí)間，在作物苗期進(jìn)行噴灑效果較好。本研究以此為參照，選擇各輪回世代的苗期進(jìn)行噴施，不會(huì)對(duì)作物產(chǎn)量產(chǎn)生影響。對(duì)不同試驗(yàn)材料噴施除草劑，噴施濃度參照李杰華等[17]研究的濃度參數(shù)，利用90 mg/L的41%農(nóng)達(dá)異丙胺鹽制劑進(jìn)行噴施，在噴施后7～10 d內(nèi)，植株產(chǎn)生輕微藥害反應(yīng)，此類單株中多數(shù)在分子檢測(cè)時(shí)均有抗性基因存在；在噴施后15～20 d內(nèi)，非抗性單株全部死亡。

(3)在原向陽(yáng)等[18]、袁權(quán)等[19]研究中均發(fā)現(xiàn)噴施草甘膦后，植株葉片中葉綠素含量出現(xiàn)不同程度的降低。光合強(qiáng)度的大小直接取決于葉綠素含量的高低，噴施草甘膦后，導(dǎo)致葉片的光合作用降低，間接影響各器官內(nèi)的干物質(zhì)含量。本研究可以直接觀測(cè)到噴施過草甘膦的葉片顏色比未噴施過草甘膦的葉片顏色淺，在今后的研究中，將對(duì)草甘膦與葉綠素含量的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證。