羅 洲，崔華偉，涂文應(yīng)，曹瑞琪，李 強(qiáng)，茍興華，程 杰

(成都大學(xué)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川，成都，610106)

1 5-氨基戊酸概述

5-氨基戊酸(5AVA)，英文名稱為5-Aminovaleric acid，分子式為C5H11NO2，分子量為117.15。5AVA溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和苯。5AVA有1個(gè)氨基和1個(gè)羧基。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。5AVA是一種生產(chǎn)尼龍5和尼龍6,5的潛在原料，也能用于合成戊二酸、δ-戊內(nèi)酰胺、1,5戊二醇和5-羥基戊酸等C5平臺(tái)化學(xué)品。目前工業(yè)上制備5AVA主要使用化學(xué)法。一般采用戊內(nèi)酰胺或戊內(nèi)酰胺聚合物水解后精制而得。這些方法與生物法相比反應(yīng)條件苛刻，能耗大，設(shè)備腐蝕大，效率低，分離復(fù)雜。因此開(kāi)發(fā)生物基來(lái)源的5AVA生物合成路線具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。5AVA可用于合成新型人造纖維尼龍5等重要工程塑料，廣泛應(yīng)用于化工、輕紡等工業(yè)。2016年，全球聚酰胺的市場(chǎng)約為240億美元，預(yù)計(jì)到2022年，市場(chǎng)需求將超過(guò)300億美元，平均年增長(zhǎng)率將超過(guò)5.5%。近年來(lái)隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，氨基酸產(chǎn)業(yè)在成本與產(chǎn)量上均取得了巨大突破。微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然氨基酸的成本持續(xù)降低，全球氨基酸產(chǎn)量預(yù)計(jì)到2022年將突破1100萬(wàn)t。我國(guó)作為氨基酸生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，大宗型氨基酸產(chǎn)品已處于供過(guò)于求的狀態(tài)。隨著L-賴氨酸合成工藝的成熟和生產(chǎn)成本的降低，其產(chǎn)能?chē)?yán)重過(guò)剩，導(dǎo)致市場(chǎng)售價(jià)大幅降低。目前賴氨酸鹽酸鹽的市場(chǎng)價(jià)格約為1700美元/t，而5AVA約為37萬(wàn)美元/t，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。因此，發(fā)展使用生物基L-賴氨酸作為初始原料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的新型生物技術(shù)，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)價(jià)值。

圖1 5AVA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 微生物中5-氨基戊酸的生物合成路徑

越來(lái)越多的環(huán)境污染、氣候變暖和能源短缺等問(wèn)題正在促進(jìn)可持續(xù)綠色的生物制造發(fā)展。利用微生物生產(chǎn)5AVA，可以減少對(duì)環(huán)境的污染，是符合國(guó)家和民族走可持續(xù)發(fā)展之路的新型制造方式。由于5AVA及其衍生物具有廣泛的應(yīng)用前景，其合成已引起眾多國(guó)內(nèi)外研究者的興趣，并開(kāi)發(fā)出許多新的合成方法和技術(shù)。目前，5AVA的生物合成主要有4種途徑(圖2～圖5)。其中，5-氨基戊酰胺介導(dǎo)合成5-氨基戊酸途徑是最重要的途徑，在惡臭假單胞菌中，L-賴氨酸通過(guò)兩步酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為5AVA。第二條途徑是戊二胺介導(dǎo)合成5AVA途徑，以L-賴氨酸為底物，通過(guò)三步酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為5AVA。第三條途徑是2-酮-6-氨基己酸介導(dǎo)的賴氨酸α-氧化酶合成5-氨基戊酸途徑，以L-賴氨酸為底物，經(jīng)過(guò)一步酶催化轉(zhuǎn)化為中間體2-酮-6-氨基己酸，中間體在過(guò)氧化氫的作用下，自動(dòng)脫羧氧化為5AVA。最后一條途徑是2-酮-6-氨基己酸介導(dǎo)的多基因合成5-氨基戊酸途徑，這是一條非天然合成途徑。

2.1 5-氨基戊酰胺介導(dǎo)合成5-氨基戊酸途徑

5AVA的天然合成途徑是在惡臭假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的，其合成途徑見(jiàn)圖2。首先，L-賴氨酸被L-賴氨酸2-單加氧酶(DavB)氧化脫羧為5-氨基戊酰胺。然后，5-氨基戊酰胺被δ-氨基戊酰胺酶(DavA)水解為5AVA。Liu等[1]將DavB和DavA進(jìn)行分離純化，利用生物酶法生產(chǎn)了20.8 g/L 5AVA，得率為0.69 g/g 賴氨酸。Wang等[2]利用全細(xì)胞催化技術(shù)，優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和金屬離子等，最終獲得了240.7 g/L 5AVA，這是目前世界上報(bào)道的最高產(chǎn)量。Li等[3]過(guò)量表達(dá)賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PP2911，進(jìn)一步強(qiáng)化了5AVA的轉(zhuǎn)運(yùn)。Joo等[4]利用芒草水解液，成功制備了12.51 g/L 5AVA。

圖2 5-氨基戊酸生物合成途徑一

2.2 戊二胺介導(dǎo)合成5-氨基戊酸途徑

Rohles等[5]建立了生產(chǎn)C5平臺(tái)化學(xué)品5AVA 與戊二胺的耦合生產(chǎn)工藝，合成途徑見(jiàn)圖3，最優(yōu)菌株能生產(chǎn)28g/L5AVA，最大生產(chǎn)率為0.9g/L/h。Jorge等[6]建立了一種戊二胺介導(dǎo)的5AVA合成途徑，以戊二胺為中間體，賴氨酸脫羧酶(LdcC)、戊二胺轉(zhuǎn)氨酶(PatA)和γ-氨基丁醛脫氫酶(PatD)三步法合成5AVA的生物合成途徑，以葡萄糖胺、木糖和阿拉伯糖為替代碳源，生產(chǎn)了5.1g/L5AVA。

圖3 5-氨基戊酸生物合成途徑二

2.3 2-酮-6-氨基己酸介導(dǎo)單基因合成5-氨基戊酸途徑

Pukin等[7]利用來(lái)源于綠色木霉的L-賴氨酸α-氧化酶(LysOx)將L-賴氨酸的α-氨基氧化成羰基，同時(shí)產(chǎn)生NH3和 H2O2，生成的中間體2-酮-6氨基己酸在不添加過(guò)氧化氫酶的情況下自動(dòng)氧化脫羧形成5AVA，利用固定化酶LysOx在37℃條件下反應(yīng)5d后成功制備了13.4g/L5AVA。Cheng等[8]將日本鯖來(lái)源的L-賴氨酸α-氧化酶(RaiP)在大腸桿菌BL21(DE3)中過(guò)量表達(dá)，敲除賴氨酸降解基因cadA以減少底物消耗，建立L-賴氨酸α-氧化酶單基因表達(dá)的代謝工程菌株。添加4%乙醇和10mM H2O2能顯著提高5AVA的產(chǎn)量，最后在5-L發(fā)酵罐中生產(chǎn)了29.12g/L 5AVA，得率為0.44g/g賴氨酸。馬金蓮等[9]發(fā)現(xiàn)L-氨基酸氧化酶可以催化L-氨基酸的氨基生成相應(yīng)酮酸，并且成功將來(lái)源于紅球菌的氨基酸氧化酶在大腸桿菌中表達(dá)，并首次用于生物催化合成5AVA。結(jié)果表明催化合成5AVA時(shí)，最適底物L(fēng)-賴氨酸濃度為17mmol/L，最適pH為7.0，最適溫度為37℃，最適時(shí)間為24h，添加0.5% H2O2，最終5AVA產(chǎn)量達(dá)到16.71mmol/L。此研究成功實(shí)現(xiàn)了L-氨基酸氧化酶合成5AVA。

圖4 5-氨基戊酸生物合成途徑三

2.4 2-酮-6-氨基己酸介導(dǎo)多基因合成5-氨基戊酸途徑

Cheng等[10]首次建立了2-酮-6-氨基己酸介導(dǎo)的5AVA合成途徑。過(guò)量表達(dá)日本鯖來(lái)源的L-賴氨酸α-氧化酶(RaiP)、乳酸乳球菌來(lái)源的α-酮酸脫羧酶(KivD)和大腸桿菌來(lái)源的乙醛脫氫酶(PadA)，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)L-賴氨酸到5AVA的生物合成。通過(guò)過(guò)量表達(dá)過(guò)氧化氫酶 KatE來(lái)分解RaiP產(chǎn)生的H2O2。利用同源性建模、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法識(shí)別突變位點(diǎn)，提出了一種可能的酶改造機(jī)制：突變體催化通道的擴(kuò)大，更多氫鍵的形成，可能更有利于底物舒展。使用了四種策略來(lái)增加5AVA的生產(chǎn)。首先，賴氨酸脫羧酶基因cadA被敲除。第二，L-賴氨酸鹽酸鹽被用作底物。第三，H2O2可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，從而影響目標(biāo)生產(chǎn)。因此通過(guò)過(guò)氧化氫酶KatE的表達(dá)，H2O2被分解，含量顯著降低。此外，賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LysP 被過(guò)量表達(dá)，加強(qiáng)底物賴氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。最后通過(guò)分批補(bǔ)料生物轉(zhuǎn)化得到52.24g/L5AVA。

圖5 5-氨基戊酸生物合成途徑四

3 提高生物合成5-氨基戊酸產(chǎn)量的策略

培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對(duì)5AVA的生物合成有顯著影響。為提高5AVA生物合成的經(jīng)濟(jì)性，研究人員對(duì)菌種選育、培養(yǎng)基成分優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化和蛋白表達(dá)優(yōu)化等策略進(jìn)行了廣泛的研究。雖然惡臭假單胞菌具有天然的5AVA 合成途徑，但發(fā)酵過(guò)程通常很長(zhǎng)，這增加了設(shè)備成本，進(jìn)一步限制了工業(yè)化的可擴(kuò)展性。因此，除了惡臭假單胞菌以外，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌合成5AVA也取得了重大突破。在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分對(duì)于代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和得率至關(guān)重要。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

由于化學(xué)合成工藝的缺陷，生物合成5AVA受到越來(lái)越多的關(guān)注。雖然在機(jī)理認(rèn)識(shí)和提高5AVA產(chǎn)量和得率方面取得了很大突破，但在經(jīng)濟(jì)上仍不具備工業(yè)化的可行性。為了將實(shí)驗(yàn)室研究成果轉(zhuǎn)化為工業(yè)過(guò)程，底盤(pán)菌種開(kāi)發(fā)和生物過(guò)程優(yōu)化之間的深度集成綜合開(kāi)發(fā)是必要的。

綜上，生物合成5AVA的方法主要有生物酶法、發(fā)酵法和全細(xì)胞催化法，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前有4種5AVA生物合成途徑。產(chǎn)量較高的是途徑一：5-氨基戊酰胺介導(dǎo)合成5-氨基戊酸途徑和途徑四：2-酮-6-氨基己酸介導(dǎo)的多基因合成5-氨基戊酸途徑，具有產(chǎn)業(yè)化前景。生物酶法需要進(jìn)一步優(yōu)化生物合成途徑，控制合成的關(guān)鍵步驟，定向進(jìn)化合成關(guān)鍵酶，從而獲得高純度的5AVA；發(fā)酵法需要進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵步驟，從而提高合成5AVA的效率；全細(xì)胞催化法需要進(jìn)一步提高催化效率，提高細(xì)胞密度。目前這些方法都處在實(shí)驗(yàn)室小試階段，還未進(jìn)行中試和產(chǎn)業(yè)化，還有待進(jìn)一步研究改進(jìn)。5AVA是合成尼龍5和尼龍5,6的重要前體物質(zhì)，如今工業(yè)生產(chǎn)5AVA污染比較大，并且生產(chǎn)效率不高，所以降低5AVA生產(chǎn)成本是可持續(xù)發(fā)展的重要研究方向，并且擁有巨大的發(fā)展前景。隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物法合成5AVA的研究也將不斷改進(jìn)，從而降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)量。

表1 5-氨基戊酸的生物合成