張雪丹 ，劉 濤 ，楊娟俠 ，王 丹 ，范 昆 ，張 倩 ，辛 力 ,*

（1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.中華人民共和國(guó)黃島海關(guān)，山東 青島 266555）

藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum L.）又名藍(lán)漿果、越橘，為杜鵑花科越橘屬植物，其果肉細(xì)膩、肉軟多汁、色澤美麗，富含花色苷等營(yíng)養(yǎng)成分和抗氧化物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。雖然藍(lán)莓果實(shí)pH較低，但因采摘時(shí)果蒂部位的傷口易受病菌感染，且采收多在高溫高濕季節(jié)，果實(shí)呼吸速率高，導(dǎo)致藍(lán)莓果實(shí)腐爛而不耐貯藏，20 ℃下貯藏期僅為一周左右，這限制了藍(lán)莓跨地域、長(zhǎng)時(shí)間、高質(zhì)量的流通和銷售[3-4]。隨著我國(guó)藍(lán)莓栽培面積的不斷擴(kuò)大和果實(shí)產(chǎn)量的持續(xù)升高，人們對(duì)藍(lán)莓鮮果采后品質(zhì)提出了更高的要求，不僅要保持較好的食用品質(zhì)和較長(zhǎng)的保鮮貨架期，還需保證其食用安全性。

咯菌腈（Fludioxonil，F(xiàn)L）是一種低風(fēng)險(xiǎn)的廣譜殺菌劑，屬于苯基吡咯家族，主要抑制灰霉菌和青霉菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[5]。目前，咯菌腈已成為先正達(dá)、拜耳和孟山都等企業(yè)生產(chǎn)的30 多種不同農(nóng)藥的主要成分，獲準(zhǔn)應(yīng)用于900 多種農(nóng)產(chǎn)品上[6]。研究表明，該殺菌劑可顯著降低檸檬[7]、石榴[8]、芒果[9]、櫻桃[10]等果品貯藏保鮮的腐爛率，延長(zhǎng)果品貯藏保鮮期的同時(shí)保持了果實(shí)品質(zhì)，因此咯菌腈在果品采后貯藏保鮮領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。但有研究表明，咯菌腈可能會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響從而影響人類健康[11]，因此各國(guó)均對(duì)咯菌腈的應(yīng)用范圍和作用物最大殘留量做出嚴(yán)格的規(guī)定。

目前，咯菌腈主要用于藍(lán)莓栽培中各種病害的防治上[12-13]，未見有咯菌腈用于藍(lán)莓采后貯藏保鮮的研究。本文以“萊格西”（Legacy）藍(lán)莓為試材，研究咯菌腈浸泡處理對(duì)采后常溫保鮮藍(lán)莓的咯菌腈殘留量、腐爛率、失重率、呼吸速率、乙烯生成速率、可溶性固形物、可滴定酸和花青苷含量等的影響，綜合評(píng)價(jià)咯菌腈用于藍(lán)莓采后貯藏保鮮的安全性和可行性，旨在為藍(lán)莓采后貯藏保鮮提供新的途徑和理論依據(jù)，為果蔬采后貯藏保鮮提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

藍(lán)莓品種為野生藍(lán)莓和高灌藍(lán)莓的雜交后代“萊格西”（Legacy），采自山東省泰安市岱岳區(qū)方泰旭瑞農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，果園為6 年生標(biāo)準(zhǔn)化藍(lán)莓園。2019 年 6 月 24 日早上采摘 8～9 成熟果，當(dāng)天上午運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，去除霉?fàn)€、蟲害、凹陷、畸形等非商品果，挑選大小、色澤一致的果實(shí)備用。

50%咯菌腈（粉劑）：先正達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、硫酸鎂、檸檬酸、氯化鉀、乙酸鈉、鹽酸、甲醇等均為分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260 高相液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；WY032T 型手持測(cè)糖儀，西安精大檢測(cè)設(shè)備有限公司；F-950 型手持式乙烯測(cè)量?jī)x，北京陽(yáng)光億事達(dá)科技有限公司；ML-204 型電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)，瑞典Amersham Biosciences 公司；5810R型高速離心機(jī)，艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

對(duì)照（CK）：藍(lán)莓在去離子水中浸泡處理10 s，然后撈出瀝干（果面無(wú)水分），裝入打孔塑料盒內(nèi)，每盒200 粒，置于20 ℃恒溫箱內(nèi)貯藏，共30 個(gè)重復(fù)。分別于貯藏 0、2、4、6、8 d 取樣，每次取樣 6 盒。

咯菌腈處理（100 mg/kg FL）：果實(shí)置于100 mg/kg的咯菌腈溶液中浸泡處理10 s，然后撈出瀝干（果面無(wú)水分），裝入打孔塑料盒，每盒200 粒，置于20 ℃恒溫箱內(nèi)貯藏，共 30 個(gè)重復(fù)。放置 0、2、4、6、8 d 取樣，每次取樣6 盒。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.2.1 咯菌腈殘留量

樣品前處理參考秦富等[14]的方法，并稍有改動(dòng)。稱取3.0 g 藍(lán)莓樣品，加入20 mL 乙腈冰浴研磨，然后加入助劑硫酸鎂（4 g）和檸檬酸（1 g）并混合振蕩30 min。經(jīng)4 000 r/min 離心5 min，取上清液加入無(wú)水硫酸鎂和N-丙基乙二胺混勻，再次離心，上清液為制備待測(cè)液。色譜柱為C18 柱，波長(zhǎng)270 nm，流動(dòng)相為水和乙腈。

1.2.2.2 腐爛率

果實(shí)表面發(fā)生汁液外漏或有肉眼可見腐爛斑點(diǎn)即為腐爛果，統(tǒng)計(jì)每盒藍(lán)莓的腐爛果數(shù)，根據(jù)下列公式計(jì)算腐爛率：

1.2.2.3 失重率

稱取每個(gè)保鮮盒內(nèi)藍(lán)莓果實(shí)的質(zhì)量m0，常溫放置2 d 后果實(shí)質(zhì)量為m2，根據(jù)下列公式計(jì)算常溫放置2 d 的失重率，以此類推分別稱量并計(jì)算保鮮4、6、8 d的果實(shí)失重率。

1.2.2.4 呼吸速率和乙烯生成速率

使用F-950 型手持式乙烯測(cè)量?jī)x測(cè)定密封容器內(nèi)藍(lán)莓果實(shí)的呼吸速率和乙烯生成速率[15-16]，其中呼吸速率以每小時(shí)每千克藍(lán)莓果實(shí)產(chǎn)生的CO2量（mg）表示，乙烯生成速率以每小時(shí)每千克藍(lán)莓果實(shí)產(chǎn)生的乙烯體積量（μL）表示。

1.2.2.5 可溶性固形物含量

將藍(lán)莓果實(shí)打漿并迅速吸取上清液2～3 滴涂在手持測(cè)糖儀上，測(cè)定可溶性固形物含量。

1.2.2.6 可滴定酸（TA）含量

采用酸堿滴定法測(cè)定，稱取10 g 果實(shí)用石英砂研磨勻漿并加蒸餾水30 mL 轉(zhuǎn)移至三角瓶?jī)?nèi)，過(guò)濾；取濾液10 mL，加入3 滴酚酞，用 0.1 mol/L NaOH 滴至溶液微紅轉(zhuǎn)白色，30 s 不褪色即為滴定終點(diǎn)，記錄消耗的NaOH 用量?？傻味ㄋ岷康挠?jì)算公式如下所示，以果實(shí)中的蘋果酸含量表示。

式中：K 為蘋果酸換算系數(shù) 0.067；A 為消耗NaOH量，mL；C 為稀釋總量；W 為樣品質(zhì)量，g；D 為測(cè)定取樣量，mL。

1.2.2.7 花青素含量

參考Lin 等[17]的雙波長(zhǎng)pH 示差法，并稍有改動(dòng)。稱取3 g 藍(lán)莓組織研磨，加入酸性甲醇（0.1% HCl）30 mL，在 45 ℃水浴鍋中提取 45 min，離心（6 000 r/min，10 min），取上清液。沉淀中加入酸性甲醇30 mL，再次提取、離心、合并上清液，重復(fù)兩次，提取的3次上清液為花青素粗提液。吸取1 mL 上述提取液，分別加入9 mL 的0.025 mol/L 氯化鉀緩沖液（pH 1.0）和0.4 mol/L 乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）稀釋，平衡15 min，然后分別在 515 nm 和 700 nm 處測(cè)定每種稀釋液對(duì)蒸餾水的吸光度值。根據(jù)下列公式計(jì)算花青素含量，結(jié)果以100 g 果實(shí)中所含有的矢車菊-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside）的量（mg）表示：

式中：ΔA 為pH 1.0 測(cè)試液在波長(zhǎng)515 nm 和700 nm處吸光度的差減去pH 4.5 測(cè)試液在波長(zhǎng)515 nm和700 nm 處吸光度的差；MW 為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2；DF 為稀釋因子；ε 為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，29 600；L 是光程厘米數(shù)，1 cm。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖使用GraphPad Prism 7 軟件，顯著性分析使用SPSS 19.0 軟件。每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 咯菌腈殘留量分析

為評(píng)價(jià)咯菌腈用于藍(lán)莓采后貯藏保鮮的食用安全性，課題組采用HPLC 法對(duì)咯菌腈溶液浸泡處理后的藍(lán)莓果實(shí)咯菌腈殘留量進(jìn)行了測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理10 s 后，藍(lán)莓果實(shí)中咯菌腈殘留量為（1.91±0.05）mg/kg（圖 1）。

圖1 HPLC 法測(cè)定藍(lán)莓中的咯菌腈殘留量Fig.1 The determination of fludioxonil residue level in blueberries by HPLC

2.2 咯菌腈處理對(duì)藍(lán)莓果實(shí)腐爛率的影響

腐爛率不僅影響果品的食用品質(zhì)，還會(huì)影響果品的商品價(jià)值。為評(píng)價(jià)咯菌腈處理抑制藍(lán)莓腐爛率的效果，開展了腐爛率調(diào)查試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。在20 ℃貯藏條件下，咯菌腈處理可以降低藍(lán)莓腐爛率。常溫放置8 d，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 處理果腐爛率為4.19%±0.53%，極顯著低于對(duì)照藍(lán)莓果的腐爛率（P＜0.01）。這是因?yàn)樵斐杀镜厮{(lán)莓腐爛的主要病菌為灰霉菌[18]，而咯菌腈可以抑制灰霉菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，因此可以有效降低藍(lán)莓的腐爛率。

圖2 咯菌腈處理對(duì)常溫貯藏期間藍(lán)莓果實(shí)腐爛率的影響Fig.2 Effect of fludioxonil treatment on decay rates of blueberry fruits during room temperature storage

2.3 咯菌腈處理對(duì)藍(lán)莓失重率的影響

藍(lán)莓果實(shí)商品性的喪失主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是腐爛敗壞，二是失水皺縮[19]。藍(lán)莓采后呼吸作用造成有機(jī)物質(zhì)的消耗和水分含量的下降，果實(shí)失重率增加。由圖3 可知，藍(lán)莓果實(shí)的失重率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，而咯菌腈處理顯著促進(jìn)了失重率的增加（P＜0.05）。20 ℃貯藏 2 d 時(shí)，對(duì)照果和 100 mg/kg FL處理果的失重率分別為0.92%±0.06%和1.04%±0.07%；貯藏8 d 時(shí)，對(duì)照果和100 mg/kg FL 處理果的失重率分別為4.47%±0.24%和4.82%±0.15%。由此可知，咯菌腈處理增加了常溫保鮮藍(lán)莓期果實(shí)的失重率。

圖3 咯菌腈處理對(duì)常溫貯藏期間藍(lán)莓果實(shí)失重率的影響Fig.3 Effect of fludioxonil treatment on weight lost rates of blueberry fruits during room temperature storage

2.4 咯菌腈處理對(duì)藍(lán)莓呼吸速率和乙烯生成速率的影響

圖4 咯菌腈處理對(duì)常溫貯藏期間藍(lán)莓果實(shí)呼吸速率的影響Fig.4 Effect of fludioxonil treatment on respiration rate of blueberry fruits during room temperature storage

圖5 咯菌腈處理對(duì)常溫貯藏期間藍(lán)莓果實(shí)乙烯生成速率的影響Fig.5 Effect of fludioxonil treatment on ethylene production rate of blueberry fruits during room temperature storage

由圖4、5 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓果實(shí)的呼吸速率和乙烯生成速率逐漸下降，但均保持中等呼吸速率和低乙烯生成速率的特性[20]。雖然100 mg/kg FL 處理果的呼吸速率在常溫保鮮期均高于對(duì)照果，但兩者無(wú)顯著性差異。與呼吸速率相同，咯菌腈處理果的乙烯生成速率均高于對(duì)照果。且在常溫貯藏2 d 時(shí)，100 mg/kg FL 處理果的乙烯生成速率顯著高于對(duì)照（P＜0.05），即100 mg/kg 咯菌腈處理顯著促進(jìn)了果實(shí)的乙烯生成速率。這種促進(jìn)作用可以提高藍(lán)莓抗病酶的活性，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過(guò)氧化物酶（POD）等[21]，從而降低果實(shí)的腐爛率和衰老程度。

值得注意的是，常溫貯藏期“萊格西”藍(lán)莓的呼吸速率和乙烯生成速率的下降趨勢(shì)相同，這可能與“萊格西”藍(lán)莓屬于高叢藍(lán)莓有關(guān)，即高叢藍(lán)莓的呼吸速率和乙烯含量在成熟期達(dá)到峰值，采后貯藏期間逐漸下降[22]。與對(duì)照果實(shí)相比，咯菌腈處理果實(shí)一直保持較高的呼吸速率（CO2生成速率）和乙烯生成速率，這可能是造成咯菌腈處理果實(shí)失重率較高的主要原因。

2.5 咯菌腈處理對(duì)藍(lán)莓可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

果實(shí)的可溶性固形物和可滴定酸含量決定了其食用時(shí)的口感和可接受程度。由表1 可知，隨著常溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓的可溶性固形物含量先降低后升高。常溫貯藏8 d 時(shí)，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s處理藍(lán)莓果實(shí)的可溶性固形物含量達(dá)到最高，為14.72%±0.14%，但與CK 相比無(wú)顯著性差異。藍(lán)莓的可滴定酸含量則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，但CK和100 mg/kg FL 處理果的可滴定酸含量均無(wú)顯著性差異，即100 mg/kg 咯菌腈處理果不會(huì)影響藍(lán)莓的可滴定酸含量。綜上所述，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 處理不會(huì)影響藍(lán)莓的食用品質(zhì)。

表1 常溫貯藏期間藍(lán)莓果實(shí)可溶性固形物和可滴定酸含量的變化Table 1 The contents of soluble solids and titration acid of blueberries storaged at room temperature

2.6 咯菌腈處理對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響

藍(lán)莓果實(shí)富含花青素，具有較強(qiáng)的抗氧化性和較高的保健價(jià)值[23]。由圖6 可見，藍(lán)莓花青素含量隨著常溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，貯藏4～8 d，100 mg/kg FL 處理果的花青素含量顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。常溫貯藏 8 d 時(shí)，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 處理果的花青素含量為（24.44±0.58）mg/100 g FW，顯著高于對(duì)照果（P＜0.05）。

圖6 咯菌腈處理對(duì)常溫貯藏期間藍(lán)莓果實(shí)花青素含量變化的影響Fig.6 Effect of fludioxonil treatment on anthocyanin content of blueberry fruits during room temperature storage

3 討論與結(jié)論

前期研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)咯菌腈的殘留量與咯菌腈浸泡后的處理方式有很大關(guān)系[24-25]。本課題組開展了咯菌腈溶液浸泡后再用水沖洗對(duì)咯菌腈殘留量的影響研究。結(jié)果表明，藍(lán)莓經(jīng)100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理10 s 后再用水沖洗5 min，咯菌腈的殘留量為（0.76±0.03）mg/kg；藍(lán)莓經(jīng) 200 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理20 s 后再用水沖洗5 min 的咯菌腈殘留量為（0.82±0.03）mg/kg。由此可知，藍(lán)莓經(jīng)咯菌腈溶液浸泡后再用水沖洗5 min 則可大大降低咯菌腈的殘留量。值得注意的是，雖然用水沖洗可以降低藍(lán)莓咯菌腈殘留量，但處理的藍(lán)莓腐爛率快速升高，因此不建議生產(chǎn)上先用高濃度咯菌腈溶液浸泡藍(lán)莓后再用水沖洗藍(lán)莓。

另外，咯菌腈殘留量還與咯菌腈的品質(zhì)狀態(tài)有關(guān)，本試驗(yàn)中的咯菌腈為先正達(dá)公司生產(chǎn)的粉劑殺菌劑，200 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理20 s 后咯菌腈殘留量為（2.97±0.16）mg/kg。而用另外一家公司生產(chǎn)的咯菌腈懸浮劑（50%）開展相同試驗(yàn)時(shí)，藍(lán)莓中咯菌腈殘留量為（6.63±0.39）mg/kg，且此處理的果實(shí)再用水沖洗5 min 后咯菌腈的殘留量為（1.84±0.15）mg/kg。

國(guó)際上有多個(gè)國(guó)家允許咯菌腈用于果蔬采后貯藏保鮮領(lǐng)域，但對(duì)其用于藍(lán)莓的最大殘留量標(biāo)準(zhǔn)較少，僅有澳大利亞新西蘭食品標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)2013 年將藍(lán)莓中咯菌腈的最大殘留量調(diào)整為1.0 mg/kg，低于其在鱗莖類蔬菜和鱷梨上的最大殘留量[26]。美國(guó)、澳大利亞和新西蘭規(guī)定核果類（桃、櫻桃、杏等）中咯菌腈的最大殘留量為5.0 mg/kg；加拿大規(guī)定葉菜類中咯菌腈的最大殘留量為30 mg/kg，西紅柿為5.0 mg/kg，豆類為0.4 mg/kg。2019 年5 月歐盟食品安全局?jǐn)M將茴香中咯菌腈的最大殘留量調(diào)整為1.5 mg/kg[27]。我國(guó)自 2020 年 2 月 15 日起實(shí)施的 GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[28]規(guī)定，藍(lán)莓果實(shí)中咯菌腈的最大殘留量為2.0 mg/kg，核果類水果的最大殘留量為5.0 mg/kg。綜合咯菌腈用于藍(lán)莓采后處理的殘留量結(jié)果，為保證果實(shí)的安全食用，建議咯菌腈用于藍(lán)莓采后保鮮的處理濃度不高于100 mg/kg。

本試驗(yàn)以“萊格西”（Legacy）藍(lán)莓為試材，研究咯菌腈浸泡處理對(duì)常溫保鮮藍(lán)莓的咯菌腈殘留量、腐爛率、失重率、呼吸速率、乙烯生成速率、可溶性固形物、可滴定酸和花青素含量的影響。結(jié)果表明，采用100 mg/kg 咯菌腈浸泡10 s 的藍(lán)莓果實(shí)咯菌腈殘留量為（1.91±0.05）mg/kg，符合 GB 2763—2019 對(duì)于藍(lán)莓咯菌腈的最大殘留量標(biāo)準(zhǔn)。另外，該處理還顯著降低了藍(lán)莓果實(shí)的腐爛率，提高了果實(shí)的呼吸速率和乙烯生成速率，后期保持較高的可溶性固形物含量，并促進(jìn)花青素的生成，但同時(shí)也促進(jìn)了果實(shí)失水，具有較高的失重率。綜上所述，100 mg/kg 咯菌腈浸泡10 s 處理藍(lán)莓果實(shí)不僅可以使其殘留量保持在較低水平，還具有降低藍(lán)莓腐爛率和保持果實(shí)品質(zhì)的作用。