武帥

摘 要：為了更好的檢測(cè)人體血清中尿素含量，為臨床醫(yī)學(xué)病情診斷提供技術(shù)支持，本文提出ILD-LCMS/MS的人體血清尿素含量測(cè)定方法。對(duì)此，本研究在傳統(tǒng)ID-GC/MS檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合同位素稀釋質(zhì)譜法對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而保證數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的回收率和精密度低，且線性范圍和檢出限在合理范圍內(nèi)。最后將測(cè)定的結(jié)果與血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度進(jìn)行對(duì)比，總的相對(duì)偏差都低于1%，證實(shí)了該方法的可行性。

關(guān)鍵詞：血清;尿素;LD-LCMS/MS;同位素稀釋質(zhì)譜法

中圖分類號(hào)：TQ441 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-5922（2021）07-0029-05

Study on the Determination of urea in Human Serum

Wu Shuai

（Clinical Laboratory， Bei qing lu Outpatient Department， Jing bei Medical District，

PLA General Hospital， Bei Jing 100094， China）

Abstract：In order to better detect the urea content in human serum and provide technical support for clinical medicine and disease diagnosis， this paper proposes the ILD-LCMS/MS method for the determination of human serum urea. In this regard， this study is based on the traditional ID-GC/MS detection method， combined with isotope dilution mass spectrometry to process the sample data， so as to ensure the accuracy of data processing. The test results show that the recovery rate and precision of this method are low， and the linear range and detection limit are within a reasonable range. Finally， the results of the determination were coMPared with the concentration of serum standard substances， and the total relative deviation was less than 1%， which confirmed the feasibility of the method.

Key words：serum; urea; LD-LCMS / MS; isotope dilution mass spectrometry

人體的血清中含有多種元素， 醫(yī)學(xué)常用通過檢測(cè)血清中元素的含量來檢查病人身體健康情況。血清中尿素、尿酸及肌酐的測(cè)定能夠給臨床醫(yī)學(xué)、病情診斷提供重要參考。目前用來測(cè)定血清中尿素、尿酸及酸酐的方式有很多，但為了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，確立標(biāo)準(zhǔn)可靠地標(biāo)準(zhǔn)化參考方法。血清中尿素測(cè)量的液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法原理可靠、前處理簡(jiǎn)單且定量準(zhǔn)確，是目前血清中尿素測(cè)量較為重要的一種候選參考方法，本文通過設(shè)置實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果的過稱確定此方法的可行性，為血清中尿素標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)物質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與試劑

1.1.1 儀器的選擇

美國安捷倫公司生產(chǎn)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀6410B;德國梅特勒公司生產(chǎn)的天平ME235S，Max=230g，d=0.01mg;天平METTLERTOLEDOUMX2，Max=2.1g，d=0.1μg;北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)的離心機(jī)LD5-2A;德國Brand生產(chǎn)的移液器：1000μL、200μL、20μL;美國ScientificIndustries生產(chǎn)的漩渦振蕩器VOREX-2GENIE;中國和利生產(chǎn)的超低溫冰箱。

1.1.2 血清樣品

本次實(shí)驗(yàn)選擇的血清樣品是由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所提供的冰凍混合人體血清。血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM909b標(biāo)準(zhǔn)I，人血清干粉，美國NIST。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

美國生產(chǎn)的尿素標(biāo)記物Urea-13c，15N2，純度99atom%13C，98atom%15N，Sigma;國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW09201，純度為99.9%，不確實(shí)度為0.2%，K=2;德國Merck生產(chǎn)的甲醇：高效液相色譜級(jí)、乙腈：高效液相色譜級(jí);實(shí)驗(yàn)用水為高純?nèi)嗡∕illipore，0.22μm）。

1.2 研究方法

本文采用的研究方法為液相色譜/大氣壓電離質(zhì)譜法。目前實(shí)驗(yàn)常用方法為氣相色譜質(zhì)譜法，但該方法需要經(jīng)過復(fù)雜的衍生化反映才能進(jìn)行氣相色譜分析。而樣品衍生過程分為2個(gè)步驟：①將尿素轉(zhuǎn)化為2-羥基嘧啶衍生物，②利用甲基硅烷化作用。但該種方法有個(gè)弊端就是尿素衍生物在短時(shí)間內(nèi)不穩(wěn)定，易分解，可能導(dǎo)致色譜峰拖尾。也就是說該種方法樣品前處理過于復(fù)雜及費(fèi)時(shí)，故此次實(shí)驗(yàn)不采用此種方式。本次實(shí)驗(yàn)采用的液相色譜/大氣壓電離質(zhì)譜法是基于Tetsuya Tamgawa，Yasuo Mlzo-oku，Kouichi Morlguchi，Takahiko Osumi和Masaaki Odomi建立的。該方法的特點(diǎn)在于直接使用高效液相色譜直接在尿素中定性定量分析，樣品前處理簡(jiǎn)單，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確和精密度皆在可接受范圍以內(nèi)。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 實(shí)驗(yàn)溶液配置及樣品預(yù)處理

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配置。尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度計(jì)算所需尿素標(biāo)志物質(zhì)量及水溶液體積（在計(jì)算時(shí)需考慮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度），精準(zhǔn)稱取實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)量精純尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)融于標(biāo)準(zhǔn)體積水溶液，通過煮沸后冷卻至室溫完成配置過程。

尿素標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度計(jì)算所需尿素標(biāo)記物13C，15N2質(zhì)量及水溶液體積（在計(jì)算時(shí)需考慮標(biāo)記物純度），精準(zhǔn)稱取實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)量精純尿素標(biāo)記物13C，15N2融于標(biāo)準(zhǔn)體積水溶液，通過煮沸后冷卻至室溫完成配置過程。

以上標(biāo)準(zhǔn)溶液配置完成以后分裝，密封后置于實(shí)驗(yàn)用超低溫空間中，-20℃的環(huán)境保存。

（2）校準(zhǔn)比值混合溶液配置。據(jù)常規(guī)方法測(cè)定的血清樣品中的大致濃度，用微量移液器將一定體積尿素標(biāo)記物溶液取出，然后加入到一定體積的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液。使得校準(zhǔn)比值溶液中尿素質(zhì)量與標(biāo)記物質(zhì)量比分別為：0.8、0.9、1.1、1.2.配置好校準(zhǔn)比值混合溶液后用進(jìn)度為d=0.01mg的天平稱量，并且記錄讀書，將室溫下充分混勻，保持平衡。

（3）血清樣品制備。將血清樣本從超低溫冰箱取出放置，待樣本在室溫條件下恢復(fù)平衡以后，稱取一定質(zhì)量的血清，再稱取前需要先輕搖混勻，避免產(chǎn)生氣泡造成影響。根據(jù)之前測(cè)定的血清樣本里尿素的大致濃度向樣品中加入一定體積的尿素13C，15N2標(biāo)記溶液，使得溶液中尿素含量與標(biāo)記物含量比值接近1∶1，將混合后的溶液稱量，記錄讀數(shù)，輕搖混勻。

將加入標(biāo)記物以后的血清樣本放置在室溫下平衡一個(gè)小時(shí)左右，在平衡后的溶液中加入一定體積的乙腈試劑，使該溶液里血清為乙腈的1/3?；旌暇鶆?，靜置沉淀蛋白質(zhì)。將沉淀后的溶液取上層清液用乙腈稀釋，稀釋至1μg/g后，用0.22μg/g的有機(jī)濾膜過濾，放入2mL樣品瓶中，進(jìn)行ID-LC/MS/MS分析。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

將樣品制備好以后，就可以計(jì)算血清濃度了。本文采用的是括號(hào)法，括號(hào)法的數(shù)學(xué)模型為圖1所示。計(jì)算公式為：

式中，c代表血清中尿素質(zhì)量濃度，單位為μg/g;mpike代表加入血清中的尿素標(biāo)記物質(zhì)量，單位為μg;mserum代表血清樣品的質(zhì)量，單位為g;RAS代表樣品中尿素與尿素標(biāo)記物面積比;RAL代表低標(biāo)中尿素與尿素標(biāo)記物面積比;RAH代表高標(biāo)中尿素與尿素標(biāo)記物的面積比;RML代表低標(biāo)中尿素與尿素標(biāo)記物的質(zhì)量比;Rmh代表高標(biāo)中尿素與尿素標(biāo)記物的質(zhì)量比。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

（1）沉淀劑用量。在確定樣品之前，我們做了多組實(shí)驗(yàn)。分別往標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)溶液里面加入一定體積的乙腈，使得乙腈與標(biāo)準(zhǔn)溶液里面的血清體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1;觀察里面的蛋白質(zhì)沉淀情況。經(jīng)過對(duì)混合溶液的觀察分析，當(dāng)乙腈與血清的體積比為3∶1時(shí)，分層明顯，上層溶液澄清，能夠完全看清蛋白質(zhì)沉淀。當(dāng)體積比為2∶1時(shí)，溶液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，當(dāng)體積比為4∶1時(shí)，沉淀效果變化不大，故最適合用于實(shí)驗(yàn)的乙腈與血清體積比例為3∶1。

（2）色譜條件。色譜柱的選擇：為了達(dá)到最好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)開始之前，對(duì)比了4種色譜柱，分別是：AgilentZORBAXRX-SIL4.6×150mm，5μm;AgilentZORBAXSB-Aq2.1×150mm，3.5μm;DikmaInertsilODS-SP2.1×150mm，5μm;VenusilMPC-18100A4.6×150mm，5μm。通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，尿素在AgilentZORBAXRX-SIL4.6×150mm，5μm上保留程度較大，故此次實(shí)驗(yàn)選擇的是AgilentZORBAXRX-SIL為分析柱。

流動(dòng)相的選擇：為了選擇出最適合的流動(dòng)相，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇/水體系及乙腈/水體系。使用甲醇/水體系時(shí)，尿素在色譜柱上保留力度較?。ˋgilent ZORBAX RX-SIL 2.1×150mm，5μm，有機(jī)相/水相=95/5，0.2mL/min，保留時(shí)間2.5min）;當(dāng)使用乙腈/水體系時(shí)，尿素在色譜柱上保留力度較大，（Agilent ZORBAX RX-SIL2.1×150mm，5μm，有機(jī)相/水相=95/5，0.2mL/min，保留時(shí)間6.8min）。

流動(dòng)相比例的優(yōu)化：為了得到最適合的流動(dòng)相比例，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)比了乙腈/水體積=95/10、95/5、98/2時(shí)的狀況，實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)乙腈/水體積比為95/5時(shí)，尿素與基底物質(zhì)中的其他物質(zhì)能夠很好的分離，且保留時(shí)間比較合適，峰形較好，用來作為流動(dòng)相正合適。

通過以上3個(gè)實(shí)驗(yàn)，選擇最適合的色譜條件為，色譜柱：Agilent ZORBAX RX-SIL（2.1×150mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈/水=95/5（V/V）;流速：0.2mL/min;進(jìn)樣量：2μL;色譜柱溫度：30℃。

（3）質(zhì)譜條件。為了得到最適合的質(zhì)譜條件，在實(shí)驗(yàn)開始前，先對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行一定分析。在全掃描（TIC）模式下，尋找分子離子峰。提取離子為尿素m/z61.1，內(nèi)標(biāo)m/z。在確定母離子后，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SIM）模式下優(yōu)化Fragmentor參數(shù)，對(duì)比Fragmentor在60V、80V、100V、120V時(shí)質(zhì)譜信號(hào)的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在60V時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)最大，故確定60V為Fragmentor參數(shù)。

在子離子掃描（Product Ion）模式下，尋找尿素及內(nèi)標(biāo)的子離子，經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標(biāo)離子分別為44.0、46.0時(shí)最適合。質(zhì)譜碎裂機(jī)理為尿素及尿素標(biāo)記物分子離子與中性碰撞氣-氨氣碰撞后，分別失去一個(gè)氨基，從而得到子離子。

在確定母離子和子離子以后，在多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式之下發(fā)生優(yōu)化碰撞（Collision Energy，CE），不同CE下質(zhì)譜響應(yīng)為表1、表2，通過觀察，在CE為20時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)最大，即將其確定為CE參數(shù)。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)譜條件為離子源：ESI（+）;數(shù)據(jù)采集時(shí)間為5min;掃描時(shí)間為200ms;MRM為m/z=61.1-44.0和64.1-46.0（尿素標(biāo)記物）;干燥氣溫度為350℃;干燥氣流速：9L /min;Nebulizer為40psi;Fragmentor為60V;CE為20V;Delta EMV為200V。

1.4 分析過程

將4個(gè)調(diào)試好的校準(zhǔn)比值混合溶液以從低到高的順序進(jìn)樣，為了測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確，每個(gè)校準(zhǔn)比值混合溶液需要重復(fù)測(cè)定3次。將尿素與尿素標(biāo)記物的面積比值作為此次實(shí)驗(yàn)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。注意，如果所得結(jié)果的RSD超過了1%，就需要重新測(cè)定。如果尿素與尿素標(biāo)記物質(zhì)量筆峰面積比圖像曲線的線性回歸系數(shù)的平方小于0.999，也需要重新測(cè)定。

每個(gè)血清樣品與它的一對(duì)標(biāo)準(zhǔn)同一批測(cè)定，在分析的時(shí)候，以高標(biāo)、樣品、低標(biāo)、樣品、高標(biāo)、樣品、低標(biāo)次序進(jìn)樣。即每個(gè)樣品都與其相鄰的低標(biāo)和高標(biāo)對(duì)比校準(zhǔn)，這樣就能保證結(jié)果的RSD在1%以內(nèi)。將實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果均值作為此次實(shí)驗(yàn)的有效數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的精密度

為了監(jiān)測(cè)此種方法的精密度，本文應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定3種不同濃度的血清。將每種濃度、每個(gè)批次平均分為3次，進(jìn)行平行測(cè)定。將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最后得出結(jié)論：該實(shí)驗(yàn)RSD值均小于1.0%，具有較好的精密度，如表3所示。

2.2 回收率

本次實(shí)驗(yàn)時(shí)以低濃度血清為研究對(duì)象，在加入一定量的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液 以后，運(yùn)用該實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定血清尿素濃度，以此研究該方法的回收率和準(zhǔn)確性。濃度為1507.466μg/g血清中尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量分別為100μL和200μL。將配好的溶液做3個(gè)平行樣品進(jìn)行測(cè)定，共測(cè)定了兩批，測(cè)定回收率分別為98.0%～102.3%和97.9%～101.1%。如表4所示。

2.3 線性范圍和檢測(cè)限

為了得到最準(zhǔn)確的結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)以尿素與尿素標(biāo)記物的質(zhì)量比對(duì)峰面積比做回歸分析。通過分析結(jié)果可知，在100～3000μg/g的范圍內(nèi)，尿素與尿素標(biāo)記物的質(zhì)量比與峰面積比呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=0.881x-0.014，R2為0.99998。

2.4 方法的驗(yàn)證

為了確定此方法的準(zhǔn)確性，用該方法檢測(cè)美國NIST血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 909b水平I兩次，且每次測(cè)試都需重復(fù)檢測(cè)4次，測(cè)定的結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)范圍以內(nèi)，證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確度。

3 定值結(jié)果

為了確定該方式在實(shí)際生活中的應(yīng)用，用本文所建立的方式分別對(duì)兩個(gè)水平的人血清中尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值。將結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表5、表6所示。

4 結(jié)論

文章設(shè)立的利用LD-LCMS/MS測(cè)定人體血清中尿素含量的方法相對(duì)于傳統(tǒng)ID_GC/MS法，前處理過程得到了較大簡(jiǎn)化。利用乙腈/水體系作為流動(dòng)相，使得尿素在色譜柱上保留時(shí)間及保留力度都較強(qiáng)，且不需要緩沖鹽，適用于質(zhì)譜的分析。選擇了同位素稀釋質(zhì)譜法能夠保證該方法的高準(zhǔn)確度與溯源性。在數(shù)據(jù)處理過程中，選用了括號(hào)法矯正質(zhì)譜儀的波動(dòng)，保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。并且利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證回收率及線性范圍，將測(cè)定結(jié)果與國際標(biāo)準(zhǔn)不確定度對(duì)比，檢測(cè)該方法的準(zhǔn)確度。最后應(yīng)用這個(gè)方式對(duì)兩種濃度的血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果只偏差0.32%和0.22%。綜上分析，建立的血清尿素測(cè)定方式相對(duì)傳統(tǒng)血清檢測(cè)方式更為簡(jiǎn)單快速，且定量準(zhǔn)確，有望成為檢測(cè)血清中尿素的參考方法，并且為后續(xù)血清尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究提供支持。

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