曾 琛 楊光華 向 森 趙富麗

宮頸癌是我國(guó)女性最常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，50%生殖系統(tǒng)惡性腫瘤均為宮頸癌，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，對(duì)女性生殖健康造成嚴(yán)重威脅。宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是一組子宮頸病變，與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。宮頸癌早期診斷、及時(shí)治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。有研究顯示，經(jīng)手術(shù)治療的早期宮頸癌患者，5年生存率高達(dá)90%。早期診斷宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物是當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)具有多種生理功能，可使細(xì)胞蛋白維持穩(wěn)定，有利于細(xì)胞生存，HSP60與惡性腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲等惡性生物學(xué)行為有關(guān)，過(guò)度表達(dá)可能與子宮頸癌侵襲前病變相關(guān)。胸苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)存在于細(xì)胞質(zhì)中，是參與DNA合成的關(guān)鍵酶，在腫瘤治療監(jiān)測(cè)方面具有重要作用，但HSP60、TK1與宮頸癌的關(guān)系尚有待研究。本研究通過(guò)檢測(cè)正常宮頸組織、CIN組織、宮頸癌組織中HSP60、TK1的表達(dá)情況，分析其與宮頸癌病理特征關(guān)系，探討HSP60、TK1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及意義，為宮頸癌臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2014年5月駐馬店市中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者42例(宮頸癌組)、CIN患者40例(CIN組)、正常宮頸健康體檢者40例(正常宮頸組)為研究對(duì)象。宮頸癌組患者，年齡41～73歲，平均(55.27±6.54)歲;鱗癌24例;腺癌18例;根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstentrics，F(xiàn)IGO)分期標(biāo)準(zhǔn)，包括Ⅰ期17例，Ⅱ期25例。CIN組患者，年齡42～71歲，平均(54.87±6.13)歲。正常宮頸組對(duì)象，年齡40～74歲，平均(55.02±6.61)歲。3組研究對(duì)象一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組研究對(duì)象一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌標(biāo)本來(lái)源于行根治性手術(shù)的患者，CIN標(biāo)本和正常宮頸組織標(biāo)本來(lái)源于行子宮手術(shù)的患者，且均經(jīng)病理檢查證實(shí)；②術(shù)前未接受放化療；③組織標(biāo)本獲取及使用均獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者。

1.2 免疫組織化學(xué)方法 采用免疫組織化學(xué)SP法(試劑盒購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司)檢測(cè)HSP60、TK1蛋白表達(dá)情況。采用10%福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約4 μm，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、0.3% 過(guò)氧化氫滅活后，抗原修復(fù)10 min。一抗4℃孵育12 h，洗滌3～4次后，生物素化標(biāo)記的鼠抗人HSP60單克隆抗體(購(gòu)自艾美捷科技有限公司)、鼠抗人TK1單克隆抗體(購(gòu)自上海群己生物科技有限公司)二抗在室溫下孵育1 h，洗滌3～4次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素孵育0.5 h，然后DAB染色(DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司)。在顯微鏡下觀察切片并拍照，HSP60、TK1蛋白表達(dá)量采用光密度表示，光密度采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 分析指標(biāo) ①比較3組受試對(duì)象的HSP60和TK1蛋白表達(dá)情況。②分析不同臨床病理特征間HSP60和TK1蛋白的表達(dá)差異。③隨訪1～72個(gè)月，以宮頸癌HSP60蛋白光密度值中位水平3.48為分界點(diǎn)，分為2個(gè)亞組(HSP60光密度值≤3.48組、HSP60光密度值>3.48組)，以宮頸癌TK1蛋白表達(dá)中位水平3.60為分界點(diǎn)，分為2個(gè)亞組(TK1光密度值≤3.60組、TK1光密度值>3.60組)，記錄不同亞組的5年生存率，分析HSP60和TK1蛋白表達(dá)對(duì)宮頸癌預(yù)后的影響。④隨訪1～72個(gè)月，按照是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組，分析影響宮頸癌預(yù)后的單因素與多因素。⑤采用Pearson相關(guān)性分析探討宮頸癌HSP60與TK1表達(dá)水平的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對(duì)象HSP60和TK1蛋白表達(dá)情況比較宮頸癌組HSP60和TK1蛋白表達(dá)水平均高于CIN組、正常宮頸組(

P

<0.05)，見(jiàn)表2。HSP60和TK1均主要表達(dá)于胞質(zhì)，胞質(zhì)呈淡黃色到棕黃色等不同染色程度，見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)HSP60和TK1蛋白表達(dá)情況(SP法)

表2 3組研究對(duì)象HSP60和TK1蛋白表達(dá)水平光密度值)

2.2 HSP60和TK1蛋白在宮頸癌不同臨床病理特征中的表達(dá)情況 不同宮頸癌分化程度、FIGO分期、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，HSP60蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；不同年齡、腫瘤直徑及病理類型間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。不同宮頸癌腫瘤直徑、分化程度、FIGO分期、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，TK1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；不同年齡、病理類型間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 HSP60和TK1蛋白在宮頸癌不同臨床病理特征中的表達(dá)情況光密度值)

2.3 不同HSP60和TK1蛋白表達(dá)水平對(duì)宮頸癌生存期的影響 所有患者隨訪1～72個(gè)月，HSP60光密度值≤3.48組5年生存率為85.71%，HSP60光密度值>3.48組5年生存率為61.90%，兩組生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。TK1光密度值≤3.60組5年生存率為90.48%，TK1光密度值>3.60組5年生存率為57.14%，兩組生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同HSP60和TK1蛋白表達(dá)水平對(duì)宮頸癌生存期的影響

2.4 不同臨床病例特征間宮頸癌復(fù)發(fā)情況的差異 隨訪1～72個(gè)月，發(fā)現(xiàn)42例宮頸癌患者中腫瘤復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡10例，遠(yuǎn)處或局部轉(zhuǎn)移給予再次放化療治療10例，無(wú)復(fù)發(fā)22例，按照是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組，兩組患者在年齡、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、FIGO分期方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，但在浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HSP60、TK1蛋白表達(dá)方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同臨床病例特征間宮頸癌復(fù)發(fā)情況的差異(例)

2.5 影響宮頸癌預(yù)后的多因素分析 經(jīng)COX分析發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)深度>1/2間質(zhì)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HSP60光密度值>3.48、TK1光密度值>3.60是影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

P

<0.05)。見(jiàn)表5、6。

表5 分析因素賦值表

2.6 宮頸癌組HSP60與TK1表達(dá)水平的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，宮頸癌組織HSP60與TK1表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性(

r

=0.058,

P

=0.713)。見(jiàn)圖3。

表6 影響宮頸癌預(yù)后的COX分析

圖3 宮頸癌HSP60與TK1表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

絕大多數(shù)宮頸癌的發(fā)生與高危型人類乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染有關(guān)，其發(fā)生過(guò)程緩慢，從正常宮頸組織高危型HPV感染到宮頸上皮內(nèi)病變，再發(fā)展為宮頸癌的時(shí)間一般需要數(shù)年。由于宮頸癌具有發(fā)病隱匿，發(fā)展速度慢等特點(diǎn)，在宮頸癌前病變階段尋找到能早期篩查、評(píng)估患者病情的標(biāo)志物，對(duì)患者病情控制及預(yù)后改善意義重大。

熱休克蛋白(heatshock proteins，HSPs)是高度保守的蛋白質(zhì)，在原核生物及真核生物中廣泛存在。近些年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，HSPs除了維持細(xì)胞正?；顒?dòng)，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起到關(guān)鍵作用。HSP60作為HSPs家族重要成員，在前列腺癌和肺癌組織中表達(dá)水平明顯升高，可作為標(biāo)志物。本研究對(duì)宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織HSP60進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，宮頸癌組織HSP60表達(dá)水平明顯高于CIN組織、正常宮頸組織，且HSP60在不同宮頸癌分化程度、FIGO分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否間中表達(dá)水平存在差異，提示HSP60可能參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展。分析原因，可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中引起蛋白異常堆積及局部細(xì)胞缺血缺氧，所以HSP60大量合成釋放，而高表達(dá)的HSP60又會(huì)增強(qiáng)癌細(xì)胞逃逸凋亡、抗應(yīng)激能力，從而促進(jìn)癌細(xì)胞異常增殖。另有研究顯示，HSP60能作用于癌細(xì)胞膜上整合素，使之活性升高，從而提高癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展。在預(yù)后方面，HSP60光密度值>3.48者5年生存率明顯低于HSP60光密度值≤3.48者；COX分析發(fā)現(xiàn)，HSP60光密度值>3.48是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示HSP60對(duì)于宮頸癌預(yù)后評(píng)估具有一定價(jià)值。

TK1是DNA合成的關(guān)鍵酶之一，惡性腫瘤患者外周血TK1水平不同程度升高。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中TK1表達(dá)量顯著高于CIN組和正常宮頸組，不同腫瘤直徑、分化程度、FIGO分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否間表達(dá)情況存在差異，提示TK1可能參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展。分析原因，TK1可催化脫氧胸苷轉(zhuǎn)化為脫氧-1-磷酸胸苷酸，保證DNA順利合成。TK1水平由細(xì)胞增殖度決定，在細(xì)胞周期G1期過(guò)渡到S期時(shí)開(kāi)始升高，并持續(xù)至M早期，可反映細(xì)胞增殖活性。有研究顯示，惡性腫瘤患者病情程度越嚴(yán)重，血液中TK1水平越高，是腫瘤治療監(jiān)測(cè)的可靠標(biāo)志物。既往一般通過(guò)檢測(cè)血清TK1水平評(píng)估腫瘤患者預(yù)后，但血清TK1水平易受血清蛋白、細(xì)胞分解等影響，存在局限性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)宮頸癌組織TK1表達(dá)量與5年生存期有關(guān)，TK1光密度值>3.60者5年生存率明顯低于TK1光密度值≤3.60者，COX分析發(fā)現(xiàn)TK1光密度值>3.60是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示TK1對(duì)于宮頸癌預(yù)后評(píng)估具有一定價(jià)值。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，宮頸癌HSP60與TK1表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)性，提示HSP60和TK1均可用于評(píng)估宮頸癌患者預(yù)后，但無(wú)明顯相關(guān)性。

綜上所述，宮頸癌組織中HSP60、TK1蛋白表達(dá)均上調(diào)，且兩者水平的升高還可能影響宮頸癌不良預(yù)后。