薛霧松，劉仍海

結(jié)直腸癌(colorectal cancer， CRC)是成人最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥相關(guān)死亡主要原因中排名第三位[1]。約1/3的CRC患者確診時已處于進(jìn)展期，失去了最佳手術(shù)時機(jī)[2]。肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的最主要因素[3-4]。因此探索CRC發(fā)展和肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，將有助于發(fā)現(xiàn)用于開發(fā)早期診斷和有效治療靶點(diǎn)的生物標(biāo)志物[5]。

現(xiàn)代中醫(yī)理論認(rèn)為，濕熱邪毒是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。結(jié)腸癌的發(fā)生是由于機(jī)體正氣不足，脾失健運(yùn)，氣機(jī)不暢，邪毒侵入，濕熱蘊(yùn)結(jié)，局部氣血運(yùn)行不暢，濕毒瘀凝下注于腸，滯留積聚所致?！秱摗分杏涊d，抵擋丸加味雞血藤可起到“祛瘀通絡(luò)，活血攻毒”的療效。已有研究表明，魚藤酮能夠顯著抑制CRC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長，其通過阻斷PI3K/AKT信號通路活性抑制Lovo和SW480結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖和轉(zhuǎn)移能力，誘導(dǎo)其凋亡[6]。抵擋丸加味雞血藤提取物中含有魚藤酮，本研究擬探討抵擋丸加味雞血藤對CRC發(fā)病和轉(zhuǎn)移的療效和機(jī)制，為其治療提供新的分子靶點(diǎn)；深化中醫(yī)藥預(yù)防和治療CRC發(fā)病及肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床治療提供新藥和指導(dǎo)法則。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞 ①實(shí)驗(yàn)動物：7～8周齡SPF級雌性裸鼠18只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：JDF-IRB-2020003801)。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，濕度55%±15%，12 h明暗光照循環(huán)。小鼠自由進(jìn)食。②實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：SW620細(xì)胞購自ATCC，培養(yǎng)條件為加有10%胎牛血清(FBS)的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 FBS和Leibovitz's L-15培養(yǎng)基購自Gibco公司；CCK8檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒、原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡試劑盒，均購自Beyotime Biotechnology；抗E-cadherin、N-cadherin、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT購自CST。抵擋丸加味雞血藤為“抵擋丸”(水蛭9 g，虻蟲9 g，桃仁6 g，大黃15 g)加味雞血藤9 g制成。

1.3CCK8細(xì)胞增殖檢測 將SW620細(xì)胞(上海奧陸生物科技)以每孔2×103個，接種到96孔板中，分別培養(yǎng)1、2、3和4 d。然后，向每個孔中加入10 μl的CCK8溶液，并通過酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度。

1.4免疫蛋白印跡 CRC細(xì)胞系SW620經(jīng)抵擋丸加味雞血藤和PI3K抑制劑LY294002處理48 h后，收集細(xì)胞，裂解后經(jīng)免疫蛋白印跡法檢測p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)情況。具體操作步驟如下：使用RIPA裂解緩沖液分離SW620細(xì)胞的蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白測定試劑盒測量蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉膜1.5 h。然后用抗E-cadherin、N-cadherin、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT孵育PVDF膜。洗滌3次后，將膜與辣根過氧化物酶-酶耦聯(lián)的二抗體孵育。使用iBright成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行可視化和定量。β-肌動蛋白作為內(nèi)部對照。E-Cadherin和N-Cadherin在提取蛋白后需超聲處理。

1.5Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測 凋亡檢測試劑盒測定凋亡細(xì)胞。將細(xì)胞以300×g離心5 min，并用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，添加結(jié)合緩沖液195 μl到細(xì)胞中，隨后加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl的PI在25℃下避光孵育20 min。通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡比例。

1.6免疫熒光染色 免疫熒光檢測SW620細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin表達(dá)情況。細(xì)胞經(jīng)過抵擋丸加味雞血藤組(1000 μg/ml)和LY294002組(500 nmol/L)處理48 h以后，加入4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌2次后，E-cadherin、N-cadherin抗體于4℃孵育過夜，次日經(jīng)PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，PBS洗滌3次后封片，經(jīng)熒光顯微鏡拍照。每片隨機(jī)選取3個視野經(jīng)IPP統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。

1.7CRC荷瘤小鼠及分組 每只裸鼠背部接種SW620細(xì)胞2×106個，待腫瘤體積達(dá)約50 mm3時，隨機(jī)分為對照組、抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組，每組6只。對照組給予生理鹽水灌胃;抵擋丸加味雞血藤組給予抵擋丸加味雞血藤100 mg/kg灌胃；LY294002組給藥劑量為10 mg/kg(藥物含量/小鼠體重)，每周3次，持續(xù)2周。腫瘤體積計(jì)算方式為：腫瘤體積=1/2×a(長徑)×b2(短徑)。

1.8腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL凋亡檢測試劑盒用于檢測腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況。腫瘤組織經(jīng)冷凍切片，片厚8 μm，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌2次，然后按說明書染色孵育顯色，最后拍照。每只小鼠腫瘤組織切片隨機(jī)選取3個視野，統(tǒng)計(jì)TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1抵擋丸加味雞血藤對細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.1.1細(xì)胞增殖情況比較：與對照組比較，CRC細(xì)胞系SW620經(jīng)抵擋丸加味雞血藤和PI3K抑制劑LY294002處理后，細(xì)胞生長速率減緩。培養(yǎng)第4天，抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組SW620細(xì)胞增殖速率顯著性低于對照組(P<0.05)；但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組SW620細(xì)胞生長速率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 3組SW620細(xì)胞增殖的抑制作用比較與對照組比較，aP<0.05

2.1.2細(xì)胞凋亡情況比較：與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組及LY294002組處理48 h后CRC細(xì)胞系SW620細(xì)胞凋亡比例顯著性升高(P<0.05)；抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、3。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測3組SW620細(xì)胞的凋亡情況

圖3 3組SW620細(xì)胞的凋亡情況比較與對照組比較，aP<0.05

2.2抵擋丸加味雞血藤對PI3K/Akt信號通路的影響 與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Ak比值顯著降低(P<0.05)，但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖4 3組SW620細(xì)胞PI3K/Akt信號通路免疫蛋白印跡圖

2.3抵擋丸加味雞血藤對SW620細(xì)胞侵襲/遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組N-cadherin表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6、7。與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組與LY29400組N-cadherin熒光顯著降低，E-cadherin熒光顯著升高(P<0.05)；但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖8、9。

圖5 抵擋丸加味雞血藤抑制PI3K/Akt信號通路的影響與對照組比較，aP<0.05

圖6 3組SW620細(xì)胞N-cadherin和E-cadherin免疫蛋白印跡圖

圖7 3組SW620細(xì)胞N-cadherin和E-cadherin表達(dá)比較與對照組比較，aP<0.05

圖8 3組SW620細(xì)胞N-cadherin和E-cadherin免疫熒光染色結(jié)果(×20)藍(lán)色熒光標(biāo)記為細(xì)胞核；綠色熒光標(biāo)記為N-cadherin/E-cadherin

圖9 3組SW620細(xì)胞N-cadherin和E-cadherin相對熒光強(qiáng)度比較與對照組比較，aP<0.05

2.4抵擋丸加味雞血藤對SW620荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用 SW620荷瘤小鼠經(jīng)抵擋丸加味雞血藤和PI3K抑制劑LY294002治療后，腫瘤生長速度明顯降低。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時，與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組小鼠腫瘤體積顯著性縮小(P<0.05);但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖10。隨后，取材經(jīng)TUNEL染色檢測腫瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，抵擋丸加味雞血藤組和LY294002組腫瘤內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著性升高(P<0.05)，但抵擋丸加味雞血藤組與LY294002組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖11、12。

圖10 3組SW620荷瘤小鼠腫瘤體積比較與對照組比較，aP<0.05

圖11 3組SW620荷瘤小鼠腫瘤TUNEL染色結(jié)果比較(標(biāo)尺長度50 μm)

圖12 3組SW620荷瘤小鼠腫瘤LUNEL涂色后細(xì)胞凋亡比較與對照組比較，aP<0.05

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)2018年全球CRC有超過180萬新診斷病例和88.1萬死亡病例，約占全部癌癥病例和死亡人數(shù)的1/10，而肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的最主要因素[1,7-8]。PI3K/AKT信號通路是腫瘤中激活最頻繁的信號通路之一，該信號通路活化是癌癥的標(biāo)志[9-11]。人類細(xì)胞中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類PI3K表達(dá)，Ⅰ類PI3K的脂質(zhì)產(chǎn)物可激活下游激酶AKT(AKT1、AKT2、AKT3)。實(shí)體癌癥中常見PI3K信號通路的激活突變，該突變率在晚期乳腺癌、胃癌和CRC等不同腫瘤類型中增加了30%～60%[12-13]。已有研究表明，PI3K/Akt信號通路異常激活與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)密切相關(guān)。EMT是腫瘤最常見的侵襲和轉(zhuǎn)移起始原因[14-16]。E-cadherin、N-cadherin是與EMT密切相關(guān)的鈣黏蛋白。在肺癌中WSTF可激活PI3K/Akt信號通路，下調(diào)E-cadherin，上調(diào)N-cadherin的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)典型的EMT形態(tài)學(xué)變化[17]。CRC中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，Gli1通過PI3K-Akt信號通路激活EMT，促進(jìn)CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18]。因此，抑制PI3K/Akt信號通路的異常激活或可抑制腫瘤的增殖和遷移。

濕熱邪毒是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一?！夺t(yī)宗金鑒》云“癰疽原是火毒生，經(jīng)絡(luò)阻塞氣血凝”，因邪熱侵襲、導(dǎo)致氣滯血瘀、腫塊形成。CRC的發(fā)生也正是由于機(jī)體正氣不足，脾失健運(yùn)，氣機(jī)不暢，邪毒侵入，濕熱蘊(yùn)結(jié)，局部氣血運(yùn)行不暢，濕毒瘀凝下注于腸，滯留積聚所致。其證候特征為局部腫塊，或腫瘤破潰，灼熱疼痛，膿血腥臭，發(fā)熱，心煩，口渴，尿赤便秘，舌紅苔黃、脈數(shù)?！办铕鐾ńj(luò)，活血攻毒”法是指由“抵擋丸”出自《傷寒論》：水蛭9 g，虻蟲9 g，桃仁6 g，大黃15 g加味雞血藤9 g治之。水蛭，功效破血，逐瘀；虻蟲，逐瘀消癥；桃仁，活血祛瘀；大黃，涼血解毒，瀉熱逐瘀；雞血藤，功效補(bǔ)血、活血、通絡(luò)。本實(shí)驗(yàn)體外研究結(jié)果表明，抵擋丸加味雞血藤可通過抑制PI3K/Akt信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞EMT形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)研究結(jié)果進(jìn)一步證明，抵擋丸加味雞血藤可顯著抑制CRC荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，在CRC細(xì)胞系SW620中，抵擋丸加味雞血藤具有顯著的抗腫瘤效果，其通過抑制PI3K/Akt信號通路的異常激活，抑制腫瘤的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin/N-cadherin表達(dá)，抑制腫瘤的EMT進(jìn)程，發(fā)揮抗腫瘤效果。本研究通過“祛瘀通絡(luò)，活血攻毒”法的干預(yù)，揭示了CRC發(fā)病和肝轉(zhuǎn)移機(jī)制；為CRC治療提供了新的分子靶點(diǎn)，深化中醫(yī)藥預(yù)防和治療CRC發(fā)病及肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床治療該病提供了新藥和指導(dǎo)法則。