黎哲昊 卜歆 封琳 胡君璧 申亮亮 關(guān)鍵

粘液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是最常見(jiàn)的原發(fā)唾液腺腫瘤，約占惡性唾液腺腫瘤的35%[1-3]。根據(jù)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)的特點(diǎn)，可將其分為低、 中、 高3 種分化類型。其中低分化腫瘤極易發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，五年生存率僅30%[4-5]。明確其發(fā)生機(jī)制，對(duì)于粘液表皮樣癌的診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療均具有重要意義。

腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞在調(diào)控腫瘤生物學(xué)行為改變方面發(fā)揮重要作用[6-7]。其中，N1型可通過(guò)分泌介導(dǎo)T細(xì)胞活化等多種方式，發(fā)揮抑癌功能；而N2型中性粒細(xì)胞可通過(guò)分泌金屬基質(zhì)蛋白酶MMP、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF等多種細(xì)胞因子的方式促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、血管發(fā)生等過(guò)程。本研究探討了中性粒細(xì)胞在調(diào)控人粘液表皮樣癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中的意義，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了解讀。

1 材料與方法

1.1 材料

MC3細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院建立，是來(lái)源于涎腺粘液表皮樣癌MEC1的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；培養(yǎng)條件為37 ℃、 5% CO2、飽和濕度的孵箱。裸鼠和C57小鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。兔抗人E-cadherin單抗、兔抗人Vimentin單抗、兔抗人TGF-β多抗(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))； 小鼠抗人β-actin單抗及Western印跡試劑盒(Sigma公司, 美國(guó))。

1.2 中性粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

利用頸椎脫臼法處死C57小鼠，分離脛骨和股骨，剪掉兩端后用稀釋液正反沖洗3 次骨髓腔至發(fā)白。收集稀釋液，利用70 μm尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移稀釋液至已加入配好小鼠骨髓中性粒細(xì)胞分離液(北京索萊寶小鼠骨髓中性粒細(xì)胞提取試劑盒)的試管中離心，離心管中出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，用吸管小心吸取分離液中位于下層的中性粒細(xì)胞層。加入5 mL 紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，用洗滌液反復(fù)3 次，得到中性粒細(xì)胞備用。

1.3 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3細(xì)胞并以106個(gè)/孔的密度接種至六孔板，待細(xì)胞貼壁后，將中性粒細(xì)胞以106/孔的密度接種至上層的0.4 μm共培養(yǎng)小室(康寧公司， 美國(guó))。48 h后，收集MC3細(xì)胞并以105個(gè)/孔的密度接種至8 μm Transwell小室；利用有基質(zhì)膠包被的小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)，無(wú)基質(zhì)膠包被的小室進(jìn)行細(xì)胞遷移能力檢測(cè)； 48 h后，將小室細(xì)胞甲醛固定并進(jìn)行結(jié)晶紫染色，用顯微鏡成像。隨機(jī)取五個(gè)視野，通過(guò)image J定量，繪制圖譜。

1.4 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)

按上述方式進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，待培養(yǎng)48 h后，分別收集上下室的細(xì)胞，用TRIzol試劑提取mRNA，用日本TaKaRa公司的PrimeScript real-time PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR。

Vimentin上游引物為5′-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3′; Vimentin下游引物為5′- CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3′； TGF-β上游引物為5′- CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3′； TGF-β下游引物為5′- GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3′； Snail上游引物為5′- TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3′； Snail下游引物為5′- AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′； β-actin上游引物為5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′； β-actin下游引物為5′- CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.5 Western印跡

按上述方式處理細(xì)胞并進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞并加入RIPA裂解液，超聲破碎細(xì)胞后4 ℃離心，取上清液，收集總蛋白；經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至NC膜；分別行5%脫脂奶粉封閉1 h、 1 ∶1000 稀釋的一抗孵育過(guò)夜、二抗孵育1 h；通過(guò)ECL發(fā)光檢測(cè)結(jié)果。

1.6 裸鼠MC3肺轉(zhuǎn)移模型建立

培養(yǎng)熒光素酶表達(dá)的MC3細(xì)胞，并制備成單細(xì)胞懸液，密度107個(gè)/ml。將裸鼠固定，于尾部中外1/3處進(jìn)針，進(jìn)行尾靜脈注射，每只小鼠注射106個(gè)細(xì)胞。4 周后，給予小鼠腹腔注射熒光素鉀鹽(150 mg/kg)，并利用活體成像儀顯色，觀察肺轉(zhuǎn)移瘤的形成與否。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

通過(guò)頸椎脫臼法處死小鼠，對(duì)肺轉(zhuǎn)移灶取材，4%甲醛固定后，制成石蠟切片，利用抗Ly6G、抗CD11b、抗Vimentin的一抗混合孵育過(guò)夜，利用對(duì)應(yīng)的二抗染色，其中Ly6G為紅色，CD11b為綠色，Vimentin為粉色。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞促進(jìn)MC3細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后的MC3細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增加(圖 1)。結(jié)果說(shuō)明，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞可增強(qiáng)MC3的遷移和侵襲能力。

2.2 腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)MC3細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)變

EMT是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，經(jīng)Western印跡和real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證明，與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后的MC3細(xì)胞中，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子Vimentin表達(dá)升高(圖 2)，提示細(xì)胞出現(xiàn)間質(zhì)化的特征。

2.3 腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞激活TGF-β-snail通路

基于TGF-β是調(diào)控細(xì)胞EMT的關(guān)鍵細(xì)胞因子，為了驗(yàn)證中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)MC3發(fā)生EMT的機(jī)制，我們對(duì)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，Western印跡和real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)與MC3細(xì)胞共培養(yǎng)后的中性粒細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)量顯著增加(圖 3A)；而經(jīng)共培養(yǎng)后的MC3細(xì)胞中Snail的表達(dá)量也顯著增加(圖 3B)。

圖 1 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MC3細(xì)胞的遷移和侵襲能力(×100)

圖 2 腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞對(duì)Vimentin表達(dá)的影響

2.4 腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)于MC3轉(zhuǎn)移瘤組織

將帶有熒光素酶標(biāo)記的MC3細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射入裸鼠內(nèi)，建立MC3肺轉(zhuǎn)移模型,并將組織切片進(jìn)行免疫熒光染色(圖 4A)。其中，Ly6G和CD11b雙陽(yáng)性的細(xì)胞為中性粒細(xì)胞(橘紅)，在中性粒細(xì)胞高表達(dá)的區(qū)域，腫瘤中的Vimentin(粉色)的表達(dá)量也顯著增加(圖 4B)。

3 討 論

中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在對(duì)抗感染和炎癥發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，中性粒細(xì)胞也扮演著重要的角色。實(shí)體瘤組織中常常伴有中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，其表型和功能具有可塑性，分為N1型和N2型[7]。其中，N1型中性粒細(xì)胞在腫瘤發(fā)生初期較常見(jiàn)，具有細(xì)胞毒性，可激活機(jī)體的抗腫瘤免疫過(guò)程抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如，通過(guò)活化活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8-10]；在集落刺激因子GM-CSF作用下通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)方式殺傷腫瘤[11]。而N2型中性粒細(xì)胞常稱為腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞，常常促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞發(fā)揮功能的方式主要有以下幾種：(1) 分泌前列腺素E2(PGE2)、MMP9促進(jìn)腫瘤的增殖[12-13]； (2) 分泌釋放彈性蛋酶NE、組織蛋白酶G參與對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解[14-15]； (3) 釋放VEGF等促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生[16]。盡管近年來(lái)人們對(duì)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的認(rèn)識(shí)逐漸增多，但其如何促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移仍有待于深入研究。

圖 3 中性粒細(xì)胞與MC3細(xì)胞的交互影響

A: MC3肺轉(zhuǎn)移小鼠活體成像； B: 肺轉(zhuǎn)移瘤組織免疫熒光染色

EMT是具有極性的上皮細(xì)胞失去緊密粘附的能力，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，向紡錘樣間質(zhì)細(xì)胞的特征轉(zhuǎn)變的過(guò)程[17]。EMT過(guò)程使得細(xì)胞骨架發(fā)生改變，細(xì)胞具有了更強(qiáng)的移動(dòng)能力，對(duì)個(gè)體發(fā)育而言，EMT是胚胎期機(jī)體組織器官形成的重要途徑[17]；而對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言，EMT是腫瘤獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的必經(jīng)過(guò)程[18-19]。細(xì)胞粘附分子E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)記分子，對(duì)維持細(xì)胞上皮樣的形態(tài)和細(xì)胞骨架至關(guān)重要，許多研究表明，腫瘤細(xì)胞僅通過(guò)抑制自身E-cadherin的表達(dá)，便能夠?qū)崿F(xiàn)EMT過(guò)程的轉(zhuǎn)變[20-21]；此外，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物在EMT過(guò)程中表達(dá)增加，如波形蛋白Vimentin、鈣黏蛋白N-cadherin、纖粘蛋白Fibronectin等。目前，能夠直接調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子家族成員已經(jīng)逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，如Twist、Snail和ZEB等。其中，Snail在影響細(xì)胞EMT的過(guò)程中地位突出，通過(guò)直接調(diào)控E-cadherin等分子的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞EMT過(guò)程的發(fā)生，并進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。臨床數(shù)據(jù)顯示，Snail的過(guò)表達(dá)與肺癌、乳腺癌等多類腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Snail作為一個(gè)重要的分子標(biāo)志物，在臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮重要作用[23-24]。

該研究利用粘液表皮樣癌模型研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β的表達(dá)，誘導(dǎo)MC3細(xì)胞內(nèi)Snail的活化，促進(jìn)細(xì)胞EMT過(guò)程的發(fā)生，導(dǎo)致的腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，在動(dòng)物模型中我們也觀察到肺轉(zhuǎn)移的MC3腫瘤周圍大量浸潤(rùn)著中性粒細(xì)胞，并與Vimentin的表達(dá)量呈正相關(guān)。

綜上，實(shí)驗(yàn)均證明腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞在誘導(dǎo)粘液表皮樣癌EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程發(fā)揮重要作用，為深入理解腫瘤微環(huán)境的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。