杜飛 喻闌清 周家喜 許紹歡 黃小貞 鄒曉

摘 要：為增加煙草制品的香味，從茅臺酒酒糟和茯磚茶中分別分離出一株產(chǎn)香酵母菌Z2和產(chǎn)香曲霉菌EC1，并采用形態(tài)及分子生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定，混以綠茶末等原料發(fā)酵，提取并添加發(fā)酵液至煙葉薄片后制成卷煙，送專家評吸，并用固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC/MS）對發(fā)酵液樣品進(jìn)行揮發(fā)性成分檢測分析。結(jié)果表明：（1）兩菌株分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和冠突散囊菌（Eurotium cristatum）;（2）原料經(jīng)發(fā)酵后能產(chǎn)生兼具茶香、酒香、蜜甜香及特殊香味的產(chǎn)物，提取并施用于煙草后可提高其感官品質(zhì);（3）SPME-GC/MS共檢出56種揮發(fā)性成分，醇類16種，占41.64%;碳?xì)浠衔镱?種，占38.01%;酮類9種，占15.99%;脂類11種，占1.55%;醛類6種，占0.74%;雜環(huán)類5種，占1.43%;酚類1種，占0.07%。利用茶葉等原料以釀酒酵母結(jié)合冠突散囊菌發(fā)酵后可獲得增加煙草制品香味的發(fā)酵液。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母;冠突曲霉;分離鑒定;微生物發(fā)酵;煙用香料

Abstract：In order to increase the aroma of tobacco products， two aroma-producing yeasts Z2 and Aspergillus EC1 were isolated from Maotai distiller′s grains and Fuzhuan brick-tea respectively， and identified by morphological and molecular biological characteristics， mixed with green tea powder and other raw materials for fermentation.After extracting and adding the fermentation broth into the tobacco leaf slices， the cigarettes were made into cigarettes， which were sent to experts for smoking， and the volatile components of the fermentation broth samples were detected and analyzed by solid phase microextraction and gas-mass spectrometry （SPME-GC/MS）.The results showed that：（1）The two strains were Saccharomyces cerevisiae and Eurotium cristatum.（2）After fermentation， the raw materials could produce products with tea， wine， sweet and special fragrance.After being extracted and applied to tobacco， the sensory quality can be improved.（3）SPME-GC/MS detected 56 kinds of volatile components， 16 kinds of alcohols， accounting for 41.64%;8 kinds of hydrocarbons， accounting for 38.01%;9 kinds of ketones， accounting for 15.99%;11 kinds of lipids， accounting for 1.55 %;6 aldehydes， accounting for 0.74%;5 heterocyclics， accounting for 1.43%;1 phenol， accounting for 0.07%.Using tea and other raw materials to ferment with S.cerevisiae combined with E.cristatum， a fermentation broth that increased the flavor of tobacco products can be obtained.

Keywords：Saccharomyces cerevisiae;Eurotium cristatum;isolation and identification;microbial fermentation;tobacco flavor

焦油作為煙草制品燃燒時(shí)釋放的主要危害物之一，“降焦減害”目前仍然是整個(gè)煙草行業(yè)亟待解決的問題[1]，在煙草中添加外源香料可改善“降焦減害”帶來的煙草制品煙味降低等缺陷[2]。近年來煙草香料愈發(fā)成為卷煙香型品類構(gòu)建的新一輪的發(fā)展戰(zhàn)略選擇，其中原料，標(biāo)準(zhǔn)和工藝是香型差異化的重要因素[3]。

微生物發(fā)酵是提高煙草制品吃味的重要途徑之一，因?yàn)樵摲ň哂胁皇軞夂驐l件限制、生產(chǎn)周期短、對環(huán)境友好等特點(diǎn)[4]。直接將產(chǎn)香微生物接種于煙葉表面進(jìn)行發(fā)酵是行之有效也是當(dāng)下最受歡迎的方法，眾研究表明，芽孢桿菌（Bacillus sp.）、微球菌（Micrococcaceae）及放線菌（Actinomycetes）等細(xì)菌類群中的部分菌種單一或混合接種于煙葉表面進(jìn)行發(fā)酵，可迅速產(chǎn)生令人愉悅的香氣，明顯改善煙葉制品吃味[5-8]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)部分真菌也能明顯改善煙葉香味、提高煙葉香氣量及香氣質(zhì)[9-10]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是兩種典型的產(chǎn)香真菌，前者在釀酒和乙醇生產(chǎn)中被廣泛利用[11-12]，后者是茯磚茶、普洱茶等發(fā)酵增香的必備菌群[13]，并且二者在煙草應(yīng)用中都有過相關(guān)報(bào)道[14-15]。

茶葉含有大量茶多酚、有機(jī)酸、氨基酸、維生素、咖啡堿及礦質(zhì)元素等，能與煙草中的尼古丁等有害物質(zhì)有效結(jié)合形成沉淀，抑制亞硝胺含量的積累，降低煙葉有害物質(zhì)對人類身體健康的損害，達(dá)到降毒增香的功效[16-17]。目前，茶葉通?？勺鳛樘砑觿┲瞥蔁熡貌枞~薄片，或直接作為香料原材料或經(jīng)微生物發(fā)酵而制備煙葉香料進(jìn)行使用，發(fā)現(xiàn)其能豐富香煙的營養(yǎng)成分且氣味芳香[18-20]，可見茶葉可作為煙葉增香香料的理想材料?；诖?，筆者設(shè)計(jì)從酒糟和茯磚茶中篩選能產(chǎn)香的微生物進(jìn)而與茶葉發(fā)酵，以期生產(chǎn)出一種適用于煙葉增香的微生物發(fā)酵產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基和儀器

采集自貴州茅臺酒廠的酒糟樣品;采集自貴州湄江印象茶葉有限責(zé)任公司的茯磚茶;購于花溪市場的綠茶;由貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供的煙葉薄片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒糟微生物分離鑒定

分離、篩選：用無菌水將酒糟樣品稀釋1000倍后，吸取200 μL稀釋液涂布于YPD培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)。待單菌落長出后，以YPD固體培養(yǎng)基分離乳白色光滑菌株，30 ℃培養(yǎng)1 d，再以約50 ℃的TTC上層培養(yǎng)基覆蓋菌落，30 ℃避光培養(yǎng)2 h，期間觀察菌落顏色變化。菌落染色越深，則“產(chǎn)酒”能力越強(qiáng)[21]，YPD斜面培養(yǎng)基冷藏形態(tài)完整且染色較深的單菌落，編號備用。

形態(tài)學(xué)鑒定：將目標(biāo)菌株接種于YPD培養(yǎng)皿，30 ℃培養(yǎng)3 d后對菌落特征進(jìn)行觀察描述，另挑取少量菌體涂布于載玻片，光學(xué)顯微鏡觀察菌株微觀形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：將所得菌株參照文獻(xiàn)[22]的方法獲取菌體，隨后按真菌DNA提取試劑盒進(jìn)行26S rDNA提取并擴(kuò)增，引物為NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′），擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明擎科生物公司測序。測序結(jié)果與BLAST序列比對，后用MEGA-X作相似性分析，并用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 茯磚茶微生物分離鑒定

分離純化：從茯磚茶“金花”處挑取少量菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，待黃色菌落長出后再進(jìn)行數(shù)次劃線分離，MYA培養(yǎng)基斜面冷藏純凈單一的菌株，編號備用。

形態(tài)學(xué)鑒定：將目標(biāo)菌株接種于MYA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后，對菌落特征進(jìn)行觀察描述，另挑取少量菌體涂布于載玻片，用棉藍(lán)染色液染色30 min，光學(xué)顯微鏡觀察菌株微觀形態(tài)，參照鄒曉等[23]方法進(jìn)行菌落和微觀形態(tài)觀察。

分子生物學(xué)鑒定：取分離菌株，接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)至長出黃色的菌落，刮取菌絲體，按真菌DNA提取試劑盒提取DNA和ITS片段擴(kuò)增，引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明擎科生物公司測序。序列處理及鑒定方法同1.2.1分子生物學(xué)鑒定方法。

1.2.3 共同發(fā)酵

選取已鑒定菌株，將菌株Z2接種于YPD液體培養(yǎng)基，28℃搖瓶3 d后靜置24 h，傾去上清液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，無菌水調(diào)整濃度為約106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，即為種子液1。將菌株EC1接種于CZG固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5 d后，以0.01%的無菌吐溫80水洗脫孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為約106個(gè)/mL的孢子懸浮液，即為種子液2。按表1（優(yōu)化后）配方將微生物種子液接種1 mL于發(fā)酵瓶中，混勻后28 ℃靜置發(fā)酵5 d。

1.2.4 香料提取

經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化，取上述發(fā)酵體系每瓶加入15 mL無菌水，攪拌均勻后用四層紗布擠壓濾去固體物質(zhì)，濾液6 000 r/min下離心5 min除去菌體及其他雜質(zhì)后取上清液，即可得到發(fā)酵香料液。參照Rutan等[24]表征香判定方法對發(fā)酵液香味進(jìn)行初步評判。參照宋培浪等[25]的方法，取樣品5 g采用SPME-GC/MS法對發(fā)酵液揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測分析，以未接種種子液的提取液為對照。

1.2.5 感官評析

基于優(yōu)化結(jié)果，取9 mL發(fā)酵液噴施于10 g煙葉薄片上，在35℃下進(jìn)行干燥30 min，在溫度為25℃、相對濕度60%下進(jìn)行水分平衡48 h后制成卷煙，編號S1;以無處理的造紙法制成的卷煙作為對照，編號S0，送貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司7名專家評吸。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種微生物鑒定結(jié)果

2.1.1 酒糟微生物

從茅臺酒酒糟中分離得到一株具有較強(qiáng)產(chǎn)酒精能力的酵母菌菌株Z2，其菌落和微觀特征如圖1所示。將菌株接種在YPD培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)2 d后，形成質(zhì)地均勻，表面和邊緣均光滑的乳白色隆起的菌落，背面透過培養(yǎng)基為淺黃色的圓形（圖1-A、B）;油鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)菌株Z2細(xì)胞為單細(xì)胞、橢圓形至圓形，5-15 μm，無性生殖方式為出芽生殖（圖1-C）。

分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，菌株Z2與NCBI數(shù)據(jù)庫中的釀酒酵母（S.cerevisiae）具有99%的同源性，以Wickerhamomyces anomalus（MT705623）作為外群，菌株Z2（MF993116）與其相關(guān)近緣屬種序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2-A所示，菌株Z2序列與S.cerevisiae形成一個(gè)亞分支，并且與S.cerevisiae（FM201319）單獨(dú)聚為一支，支持率達(dá)到100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，可確定從酒糟中分離得到的菌株Z2為釀酒酵母（S.cerevisiae）。

2.1.2 茯磚茶微生物

從湄潭茯磚茶中分離得到一株具有產(chǎn)香功能的真菌菌株，編號為EC1，其菌落和微觀特征如圖1所示。將菌株接種在MYA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)5 d后，形成黃色菌斑，邊緣為白色的菌絲向四周輻射，靠近邊緣為淺黃色，菌落中心顏色較深，背面中心為棕色，顏色從中心向邊緣逐漸變淡（圖1-D、E）;鏡檢（10×20）可發(fā)現(xiàn)大量閉囊殼和菌絲體，閉囊殼近球形或球形，連接眾多菌絲，菌絲卷曲后進(jìn)一步分化（圖1-F）;在高倍鏡（10×40）下可見閉囊殼破裂后釋放大量金黃色孢子（圖1-G）。

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