李顯波 楊洋 彭劍濤 吳有祥 歐明毅 劉素參

摘 要：為探討貯存時間和產地對煙葉中性致香物質含量的影響，選取2012年、2013年和2014年入庫的云南楚雄、貴州黔西南及福建三明復烤片煙，采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結合氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）技術測定其主要中性致香物質含量，采用方差分析、熱力圖、主成分分析及判別因子分析等手段分析香氣物質特征，研究不同貯存時間和產地煙葉中性致香物質的含量差異和特征差異。研究結果表明，類胡羅卜素降解產物、揮發(fā)性醇類、揮發(fā)性酮類、新植二烯、西柏烷衍生物、其它類和中性致香物質總含量隨著貯存時間的延長均呈現(xiàn)先升高而后顯著降低的變化趨勢，不同產地間各中性致香物質含量也存在著較大差異，以直鏈脂肪酸酯、烴類和揮發(fā)性醇類的含量差異最為明顯。通過對中性致香物質的特征分析發(fā)現(xiàn)，可將中性致香物質作為判定不同產地和醇化程度的相關指標，判定方法則以判別因子分析最為適宜。

關鍵詞：煙葉;貯存時間;產地;中性致香物質;判別因子分析

Abstract：In order to explore the effects of storage time and place of origin on the content of neutral aroma substances in tobacco leaves，flue-cured tobacco from Chuxiong of Yunnan province，Qianxinan of Guizhou province and Sanming of Fujian province，which were put into storage in 2012，2013 and 2014，were selected to determine the content of neutral aroma substances by headspace solid phase microextraction （HS-SPME） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）.The characteristics of aroma compounds were analyzed by variance analysis，thermodynamic diagram，principal component analysis and discriminant factor analysis，and the differences and characteristic changes of neutral aroma compounds in tobacco leaves in different storage time and producing areas were studied.The results showed that the total contents of carotene degradation products，volatile alcohols，volatile ketones，neophytadienes，cypressene derivatives，other types and total content of neutral aroma compounds showed a trend of first increase and then significant decrease with the extension of storage time.There were also significant differences in the contents of neutral aroma compounds among different production areas，with the most obvious differences in the content of straight-chain fatty acid esters，hydrocarbons and volatile alcohols.Through the analysis of the characteristics of neutral aroma compounds，it is found that neutral aroma substances can be used as the relevant indicators to determine different producing areas and storage time，The determination method is the most appropriate discriminant factor analysis.

Keywords：tobacco leaf; storage duration; producing area; neutral aroma substance; discriminant factor analysis

煙葉經過采收、初烤、復烤后，往往還存在青雜氣較重、刺激性較大、吃味不夠醇和等品質缺陷，不能直接用于卷煙生產[1-3]，為了減小煙葉品質上的不足，工業(yè)上往往將復烤后的煙葉進行醇化，以達到消除青雜氣、減輕刺激性、改善余味及提高煙葉燃燒性等目的，減少煙葉品質的固有缺陷，滿足工業(yè)生產的需求[3-6]。醇化是卷煙生產過程中改善煙葉品質和提高煙葉可用性必不可少的重要環(huán)節(jié)，也是改善煙葉質量必不可少的環(huán)節(jié)之一[7-9]。煙葉醇化可促進煙葉內在化學成分的轉化，通過一系列的化學及生物反應將不利于煙葉品質的組分轉換成有利于提升煙葉品質組分的過程[10-12]。致香物質指分子量小、具有揮發(fā)性、可以作用于人的嗅覺器官、使人產生愉悅感覺的化學成分，直接影響了煙葉的品質，很大程度上決定了煙葉品質的優(yōu)與劣，是評定煙草及其制品的重要因素之一[13-14]。

國內外對煙葉醇化過程中致香物質和感官質量的變化展開了大量研究[15-19]，但大多都局限于分析煙葉醇化過程中煙葉致香物質和感官質量的變化趨勢，沒有對致香物質相關特征進行分析，也未系統(tǒng)闡明致香物質含量差異與煙葉醇化時間和產地的關系。因此，本文采用方差分析、熱力圖、主成分分析、判別因子分析探討產地及貯存時間對煙葉中性致香物質含量的影響，并通過分析不同產地煙葉在醇化過程中中性致香物質特征差異，為更好地闡釋中性致香物質含量在不同產地和貯存時間的變化及其特征差異提供一定的依據(jù)，為評判煙葉醇化程度提供相關指標和鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取2012年、2013年和2014年入庫的云南楚雄、貴州黔西南及福建三明復烤片煙，于2017年9月取樣，2018年10月測定煙葉中性致香物質含量，樣品由貴州中煙工業(yè)有限公司技術中心提供并進行感官質量評價。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法

取樣時采用五點取樣法，從煙葉醇化庫中選取對應醇化時間和產地的醇化煙葉，抓取共計0.5 kg的煙葉樣品。

1.2.2 樣品制備

將煙葉在烘箱中于45℃條件下烘干5 h后研磨（粉碎時間為20 s），過40目篩后裝在自封袋中，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 測定項目與方法

中性致香物質的測定：稱取3 g（準確至0.01 g）樣品，放入20 mL頂空瓶中，加入20 μL濃度為3.059 mg/mL乙酸苯乙酯的二氯甲烷溶液作為內標，加蓋密封。采用DVB/CAR/PDMS萃取頭和CTC/Combo/PAL自動進樣器進行頂空萃取，萃取溫度80℃，平衡時間30 min，萃取時間1200 s。萃取結束后纖維頭插入進樣口，于250℃不分流進樣模式下解析5 min。NIST08和WILEY275譜庫檢索定性，內標法定量，重復稱量測定3次。

色譜條件：DB-5MS毛細管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;程序升溫：初始溫度60℃，以5℃/min升至130℃，然后以1℃/min升至140℃，最后以5℃/min升至240℃，保持10 min;進樣口溫度：270℃;傳輸線溫度：270℃;不分流進樣;載氣：氦氣，流速為1.0 mL/min。

質譜條件：EI源;電子轟擊能量：70 eV;離子源溫度：230℃;質量掃描范圍33～350 u。

感官質量評價：由貴州中煙工業(yè)有限責任公司技術中心組織感官質量的評吸，將各貯存時間和產地的煙葉卷制成卷煙成品，分發(fā)于各評吸專家（7人以上），對其香氣質、香氣量、吃味、雜氣、刺激性進行打分，計算各專家打分平均分作為感官質量評分。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行整理與制圖，SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)的方差分析，Origin 2019實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的主成分分析、判別因子分析和熱力圖。

2 結果與分析

2.1 貯存時間和產地對煙葉中性致香物質和感觀質量的影響

2.1.1 醇化年限和產地對煙葉感官質量的影響

由表1可知，隨著煙葉貯存時間的增加，三明煙葉的香氣質無變化，香氣量和吃味呈現(xiàn)先增后穩(wěn)定不變，雜氣先減后增，刺激性先增后穩(wěn)定不變，總得分逐漸升高的趨勢;黔西南煙葉的香氣質、香氣量、吃味、雜氣呈現(xiàn)先增后減，刺激性先減后穩(wěn)定不變，總得分逐漸升高的趨勢;楚雄煙葉香氣質和吃味無變化，香氣量、刺激性、總得分先減后增，雜氣逐漸降低的趨勢。不同產地間，香氣質在各產地間無明顯差異，三明和黔西南煙葉的香氣量和總得分高于楚雄，刺激性低于楚雄，三明煙葉雜氣較高，黔西南煙葉吃味較低，楚雄煙葉刺激性較高。但在不同貯存時間和不同產地間煙葉各感官質量得分的變化并不大。

2.1.2 醇化年限和產地對煙葉中性致香物質的影響

表2為不同貯存時間和不同產地間煙葉中性致香物質含量的方差分析，從中可知，新植二烯和西柏烷衍生物茄酮的含量最高，在16.65～41.50 μg/g間，類胡羅卜素降解產物和、揮發(fā)性酮類和其他類次之，含量在0.58～1.58 μg/g間，直鏈脂肪酸酯和烴類最低，為0.10～0.47 μg/g間，中性致香物質的含量呈現(xiàn)新植二烯、西柏烷衍生物>類胡羅卜素降解產物、揮發(fā)性酮類>揮發(fā)性醇類>直鏈脂肪酸酯、烴類。隨著貯存時間的延長，煙葉中性致香物質含量總體呈現(xiàn)先顯著升高后顯著降低的變化趨勢，2013年入庫的煙葉中性致香物質含量最高，2012年的最低，其中以新植二烯、揮發(fā)性酮類、西柏烷衍生物和類胡羅卜素降解產物的變化差異最為明顯;不同產地煙味中性致香物質含量呈現(xiàn)岀部分的顯著差異，其中直鏈脂肪酸酯含量在不同產地和不同貯存時間均達到顯著差異，烴類物質含量在2012年和2014年三明煙葉顯著低于黔西南和楚雄，揮發(fā)性醇類黔西南煙葉在2013年顯著低于三明和楚雄，三明煙葉揮發(fā)性酮類和新植二稀含量在2014年顯著高于楚雄，黔西南煙葉西柏烷衍生物含量在2012年顯著高于三明。

2.2 中性致香物質的特征分析

2.2.1 中性致香物質的熱力圖

圖1是對煙葉中性致香物質含量進行歸一化處理后的熱力圖。在不同貯存時間煙葉中性致香物質含量隨貯存時間呈現(xiàn)先增加后降低的變化，但其含量總體呈降低的趨勢，2013年入庫煙葉的含量明顯高于2012年和2014年;不同產地煙葉2014年入庫的三明煙葉除烴類、其它類和揮發(fā)性醇類明顯低于黔西南和楚雄，其余中性致香物質含量明顯高于黔西南和楚雄，2012年和2013年三明煙葉直鏈脂肪酸酯含量明顯高于黔西南和楚雄，烴類明顯低于黔西南和楚雄，三明煙葉西柏烷衍生物在2012年明顯低于黔西南和楚雄，揮發(fā)性酮類高于黔西南和楚雄。表明通過熱力圖可以明顯的看出不同貯存時間中性致香物質的含量差異，不同產地間揮發(fā)性酮類、直鏈脂肪酸酯、烴類含量有著明顯差異。

2.2.2 中性致香物質的主成分分析

圖2為基于中性致香物質含量的3個貯存時間和3個產地的煙葉樣品PCA第1、2主成分得分圖。通過主成分分析的橫坐標（第一主成分得分）可將2013年入庫煙葉與2012年和2014年入庫的煙葉很好地區(qū)分開，但不能區(qū)分2012年和2014年入庫的煙葉;縱坐標（第二主成分得分）可將福建三明煙葉與貴州黔西南和云南楚雄煙葉區(qū)分開，不能區(qū)分貴州黔西南和云南楚雄煙葉。表明貴州黔西南和云南楚雄煙葉中性致香物質特征較為接近，均與福建三明煙葉存在明顯區(qū)別;2013年入庫煙葉中性致香物質特征與2012年和2014年煙葉差異較大。

2.2.3 中性致香物質的判別因子分析

圖3為基于中性致香物質含量的3個產地和3個貯存時間的判別因子分析圖。通過判別因子分析可將不同貯存時間和不同產地的煙葉區(qū)分開。A為3個產地的判別因子分析，其中貴州黔西南和云南楚雄有部分重疊，但總體能夠將3個產地的煙葉區(qū)分開來;B為3個貯存時間的判別因子分析，圖中各不同貯存時間能較好的聚集并分散開，沒有重疊的現(xiàn)象，說明能將不同貯存時間的煙葉很好地區(qū)分開。表明貴州黔西南和云南楚雄煙葉中性致香物質特征存在相似之處，而福建三明煙葉則與二者區(qū)別明顯;不同貯存年限煙葉中性致香物質特征差異明顯。

3 結論與討論

煙葉在醇化過程中，隨著醇化時間的增加，中性致香物質含量呈先升高后降低的變化趨勢，這與胡有持[20]、鄭峰洋[21]等通過對復烤片煙進行醇化研究發(fā)現(xiàn)，煙葉中多數(shù)致香物質的含量隨醇化時間的增加呈先升后降趨勢，其研究結果相一致;不同產地間煙葉中性致香物質含量有著部分差異，煙葉感官質量在不同醇化時間和不同產地均無明顯的差異，感官質量主要是依靠評吸人員對其進行抽吸，并對主要評價指標進行評分來鑒定，但每個人對其特定評價指標的感覺均不相同，帶有很大的主觀性，且煙葉達到醇化已達的狀態(tài)，品質穩(wěn)定，人的感官靈敏度很難區(qū)分不同產地和醇化時間各指標的差異，導致感官質量沒有明顯差異。歸一化處理的熱力圖能夠明顯地看岀不同醇化時間煙葉致香物質含量的動態(tài)變化差異，但不同產地間部分致香物質含量差異不明顯，其致香物質含量相對一致，歸一化時數(shù)值較為接近，導致其差異不太明顯。

主成分分析能較好區(qū)分岀不同香型香韻煙葉，判別因子分析能很好判別不同產地和貯存時間的煙葉，且兩個分析方法都有著明顯特征差異。研究表明致香物質大多是煙葉次生代謝的產物，煙葉致香物質前體物是煙葉在生長發(fā)育中形成的[22];烤煙香型香韻的不同是由于煙葉內各種致香物質的比例不同造成[23]，不同產地的煙株生長發(fā)育條件有著或多或少的不同，導致煙葉致香物質含量有著部分差異;醇化過程中煙葉致香物質前體物發(fā)生降解和轉變，使其進入次生代謝途徑[24]，間接影響煙葉致香物質的含量，從而導致煙葉在不同貯存時間致香物質含量有著明顯差異。主成分分析能區(qū)分岀部分貯存時間和產地的煙葉，2013年入庫的煙葉致香物質含量顯著高于2012年和2014年，同時貴州黔西南和云南楚雄的煙葉同屬于西南高原生態(tài)區(qū)—清甜香型，福建三明的煙葉則屬于武夷陵區(qū)生態(tài)區(qū)—清甜蜜甜香型[25-26]，導致其不能很好地區(qū)分開貴州黔西南和云南楚雄的煙葉。判別因子分析能很好地區(qū)分開不同醇化時間的煙葉，而產地間貴州黔西南和云南楚雄有著部分重疊，且兩個產地同屬于一個香型香韻，說明其致香物質特征有著相似之處，應用判別因子分析可以較為明顯的將兩個產地的煙葉區(qū)分。

在不同貯存時間和不同產地煙葉中，通過對中性致香物質含量進行歸一化處理的熱力圖可視化分析，能直觀地看出各中性致香物質含量間的差異?；谥行灾孪阄镔|含量的主成分分析能區(qū)分2013年入庫的煙葉和福建三明的煙葉，2012年和2014年入庫的煙葉，其物質含量的差異較小，通過對中性致香物質含量的判別因子分析，其結果能夠很好地判別出不同貯存時間和不同產地的煙葉，尤其是不同醇化時間的效果。中煙公司常將煙葉的感官質量作為評價醇化程度的標準，而致香物質又直接作用于人的感官，影響著煙葉的感官質量，因此煙葉致香物質含量作為評價醇化程度的指標具有一定的可行性，同時中性致香物質判別因子分析能夠判別不同產地和貯存時間煙葉，就算產地間屬于同一個香型香韻的煙葉，也能較好區(qū)分不同產地，為此可將判別因子分析作為適宜的分析方法。

煙葉感官質量在不同貯存時間和產地間均無明顯變化;類胡羅卜素降解產物、揮發(fā)性醇類、揮發(fā)性酮類、新植二烯、西柏烷衍生物、其他類和中性致香物質總含量隨著貯存時間的延長均呈現(xiàn)先顯著升高后顯著降低的變化趨勢，不同產地間各中性致香物質含量也存在著較大差異，其中以直鏈脂肪酸酯、烴類和揮發(fā)性醇類的含量差異最為明顯。通過對中性致香物質的特征分析發(fā)現(xiàn)，熱力圖能直觀的看出不同貯存時間含量的差異，判別因子分析能明顯的區(qū)分不同產地和醇化時間的煙葉，主成分分析能區(qū)分不同香型香韻和致香物質含量差異較大的煙葉;為此可將中性致香物質作為判定不同產地和醇化程度的相關指標，判定方法則以判別因子分析最為適宜。

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