馮鵬鵬，孫麗靜，肖冬光，謝鑫，宋富，張翠英*

（1.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101300）

在啤酒釀造過程中，啤酒酵母除產(chǎn)生主要代謝產(chǎn)物乙醇外，還會(huì)產(chǎn)生酸類、酯類、高級(jí)醇類、醛類、酚類等風(fēng)味物質(zhì)[1]。而高級(jí)醇是最重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇和苯乙醇等。

啤酒中高級(jí)醇的含量一般為70 mg/L～100 mg/L，而部分優(yōu)質(zhì)的清爽型啤酒中高級(jí)醇含量能夠控制在50 mg/L～90 mg/L[2]。高級(jí)醇含量過低，會(huì)使酒體不豐滿，口感較差，但其含量過高，不僅影響酒體的協(xié)調(diào)性，還會(huì)對(duì)飲用者的身體產(chǎn)生明顯的副作用。所以在啤酒的釀造過程中，如何把高級(jí)醇的含量控制在一個(gè)合理范圍之內(nèi)，是一個(gè)非常關(guān)鍵的問題。

1 啤酒酵母高級(jí)醇代謝途徑

在啤酒酵母中，α-酮酸脫羧成醛后再被還原可以生成相應(yīng)的高級(jí)醇。一般而言，根據(jù)α-酮酸來源方式的不同，將酵母生成高級(jí)醇的途徑分為分解代謝途徑（Ehrlich途徑）和糖代謝途徑（Harris途徑）。

1.1 分解代謝途徑（Ehrlich途徑）

1907年，德國化學(xué)家Ehrlich首先提出由氨基酸可以生成高級(jí)醇，即所謂的Ehrlich途徑，如圖1所示。

圖1 Ehrlich途徑Fig.1 Ehrlich pathway

啤酒酵母在利用糖類生成酒精的過程中，由蛋白質(zhì)分解而來的氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶催化下生成相應(yīng)的α-酮酸和谷氨酸，α-酮酸經(jīng)脫羧酶和脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化為各種高級(jí)醇。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中的異丁醇、異戊醇、活性戊醇有大約25%來源于此途徑[3]。在此途徑下，纈氨酸生成異丁醇，亮氨酸生成異戊醇，苯丙氨酸生成苯乙醇，異亮氨酸生成活性戊醇[4]

1.2 糖代謝途徑（Harris途徑）

1953年，Harris提出高級(jí)醇可在葡萄糖經(jīng)糖代謝合成氨基酸的過程中生成，如圖2所示。

圖2 糖代謝途徑（Harris途徑）Fig.2 Metabolism pathway of carbohydrate（Harris pathway）

葡萄糖先后經(jīng)過糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)生成的α-酮酸可以和NH3作用生成氨基酸，同時(shí)也可以在酮酸脫羧酶、脫氫酶的作用下生成高級(jí)醇。

2 高級(jí)醇代謝調(diào)控機(jī)理及關(guān)鍵基因

啤酒中的高級(jí)醇既可來源于Ehrlich途徑，又可由糖代謝途徑生成。當(dāng)啤酒酵母在發(fā)酵過程中氨基酸含量十分豐富時(shí)，便會(huì)通過Ehrlich途徑生成高級(jí)醇，主要包括酪醇、色醇、苯乙醇等10種高級(jí)醇的生成，相反，當(dāng)某種必需氨基酸不足時(shí)，酵母會(huì)通過糖代謝途徑合成氨基酸來滿足自身生長需求，若此過程中氮源不足，糖代謝中間產(chǎn)物α-酮酸就會(huì)由于不能轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)氨基酸而積累，并在α-酮酸脫羧酶及醇脫氫酶的作用下生成高級(jí)醇，最重要的便是支鏈氨基酸的從頭合成途徑[5]。主要高級(jí)醇生成途徑如圖3所示。大致可以分為上下游兩部分。上游途徑：氨基酸/丙酮酸到α-酮酸；下游途徑：α-酮酸脫羧還原為對(duì)應(yīng)的高級(jí)醇。

圖3 高級(jí)醇代謝途徑Fig.3 Metabolism pathway of higher alcohol

2.1 異丁醇途徑及關(guān)鍵基因

異丁醇可以由纈氨酸分解而成（Ehrlich途徑）。即纈氨酸經(jīng)胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（BAT2基因編碼）作用轉(zhuǎn)氨為 α-酮異戊酸（α-ketoisovalerate，KIV），隨后KIV在酮酸脫羧酶（2-keto-acid decarboxylase，KDCs）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADHs）催化下脫羧還原為異丁醇。同樣，異丁醇也可由糖代謝途徑生成。兩分子糖酵解而來的丙酮酸在乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）的作用下縮合為2-乙酰乳酸（2-acetyl lactate，ALAC）和二氧化碳，乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）將 ALAC 還原為 2，3-二羥基異戊酸（2，3-dihydroxyisovalerate，DIV）后再經(jīng)二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）作用脫水為KIV，生成的KIV可以在支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（BAT1基因編碼）的催化下轉(zhuǎn)化為纈氨酸，也可以經(jīng)酮酸脫羧酶（ketonic acid decarboxylase，KDCs）和乙醇脫氫酶（ADHs）的催化生成高級(jí)醇。共同的中間產(chǎn)物KIV將異丁醇生成的兩種途徑相偶聯(lián)，依據(jù)酵母需求生產(chǎn)高級(jí)醇[6]。

參與異丁醇合成過程中的關(guān)鍵酶有支鏈氨基酸滲透酶（BAP2基因編碼）、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（branched-chain amino acid transaminase，BCATs）、乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）及二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）。分別負(fù)責(zé)支鏈氨基酸的攝取、降解及中間產(chǎn)物KIV的生成，所以它們的表達(dá)將影響異丁醇的產(chǎn)量。支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（BCATs）位于線粒體（Bat1p）和胞漿（Bat2p）中，催化支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAAs）的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，有研究表明BAT1基因傾向于催化氨基酸合成，而BAT2基因更傾向于氨基酸的降解[7]，這可能是由于它們所處環(huán)境的不同所造成的。HAMMER等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中敲除BAT1基因后能顯著提高異丁醇的產(chǎn)量，特別是當(dāng)培養(yǎng)基中不含纈氨酸時(shí)，可使異丁醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株增加14.2倍。原因可能是敲除BAT1基因后KIV轉(zhuǎn)化為纈氨酸的能力減弱，KIV在線粒體中積累促進(jìn)了異丁醇的產(chǎn)生。恰好這也進(jìn)一步驗(yàn)證了之前所說的BAT1基因更傾向于催化氨基酸合成以及大部分異丁醇是酵母通過糖代謝生成的觀點(diǎn)。同時(shí)，MA等[9]研究發(fā)現(xiàn)，敲除BAT2基因或過度表達(dá)BAT1基因都可以降低異丁醇含量，而敲除BAT2基因的同時(shí)過表達(dá)BAT1基因可以使異丁醇的含量進(jìn)一步降低；Bap2p作為支鏈氨基酸滲透酶，與一般氨基酸滲透酶（由GAP1基因編碼）等一起負(fù)責(zé)氨基酸的攝取，不過它優(yōu)先負(fù)責(zé)支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究發(fā)現(xiàn)，BAP2基因的缺失可使纈氨酸攝取量減少45%左右[10]，而纈氨酸又參與異丁醇的合成，所以BAP2基因的表達(dá)與異丁醇有一定關(guān)聯(lián)；乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）、二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）是催化丙酮酸生成中間產(chǎn)物α-酮異戊酸（KIV）的關(guān)鍵酶，AVALOS等[11]研究表明，ILV基因的單獨(dú)過表達(dá)可使異丁醇的產(chǎn)量增加約5倍；由于異丁醇天然途徑中最后兩步反應(yīng)在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，所以KIV在線粒體中合成后需運(yùn)輸?shù)桨麧{后才能生成異丁醇。為了克服異丁醇合成過程中KIV跨膜運(yùn)輸?shù)恼系K，Brat等[6]將纈氨酸生物合成酶基因ILV2、ILV5和ILV3由線粒體中重新定位到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中形成了完整的異丁醇合成途徑從而提高異丁醇的產(chǎn)量。同時(shí)WESS等[12]也指明在細(xì)胞質(zhì)中過表達(dá)纈氨酸合成途徑的乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）和二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）3種內(nèi)源性酶的同時(shí)阻斷線粒體纈氨酸合成的第一步，可使異丁醇產(chǎn)量增加22倍，達(dá)到0.22 g/L。

2.2 活性戊醇途徑及關(guān)鍵基因活性

Ehrlich途徑：異亮氨酸轉(zhuǎn)氨為α-酮-3-甲基戊酸，α-酮-α-甲基戊酸可以通過酮酸脫羧酶脫羧轉(zhuǎn)化為α-甲基丁醛后被還原成活性戊醇[13]。

Harris途徑：丙酮酸合成的α-酮丁酸在ILV基因的作用下生成α-酮-3-甲基戊酸，后經(jīng)酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶作用生成活性戊醇。其中，中間產(chǎn)物α-酮丁酸由丙酮酸途徑、高絲氨酸途徑、蘇氨酸途徑3種途徑生成。

丙酮酸途徑：糖酵解而來的丙酮酸在異丙基蘋果酸合成酶（LEU1基因編碼）催化下生成β-蘋果酸甲酯，β-蘋果酸甲酯再轉(zhuǎn)化為α-酮丁酸。

蘇氨酸途徑：天冬氨酸經(jīng)高絲氨酸生成蘇氨酸，蘇氨酸在ILV1（蘇氨酸脫氨酶）的作用下轉(zhuǎn)化成α-酮丁酸。

高絲氨酸合成途徑：此途徑目前尚未被研究明確，可能是高絲氨酸依次轉(zhuǎn)化為中間物質(zhì)O-乙酰高絲氨酸、胱硫醚，最后形成最終產(chǎn)物α-酮丁酸[14]。據(jù)報(bào)道α-酮丁酸脫羧還原后可生成正丙醇[15]。

ILV基因、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因（BAT1、BAT2）是活性戊醇合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。同異丁醇途徑相似，活性戊醇的上游途徑也在線粒體中進(jìn)行，其中間產(chǎn)物α-酮-3-甲基戊酸由ILV基因催化生成，有研究者發(fā)現(xiàn)，過度表達(dá)ILV基因可使活性戊醇的產(chǎn)生量與對(duì)照菌株相比略有增加[11]。

2.3 異戊醇途徑及關(guān)鍵基因

如圖3所示，異戊醇既可以通過Ehrlich途徑由亮氨酸分解而成，也可以經(jīng)亮氨酸生物合成途徑產(chǎn)生。丙酮酸依次在乙酰乳酸合酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）、二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）的作用下生成α-酮異戊酸，此部分在線粒體中進(jìn)行，隨后經(jīng)2-異丙基蘋果酸合酶（LEU4基因編碼）、異丙基蘋果酸異構(gòu)酶（LEU1基因編碼）和2-異丙基蘋果酸脫氫酶（LEU2基因編碼）作用生成α-酮異己酸（α-ketoisocaproate，KIC）。最后，KIC（由 Ehrlich 途徑和亮氨酸從頭合成途徑而來）在α-酮酸脫羧酶（KDCs）和乙醇脫氫酶（ADHs）的催化下生成異戊醇。

啤酒酵母中異戊醇生成的上游途徑（丙酮酸到α-酮異己酸）由乙酰乳酸合成酶（ILV2基因編碼）、乙酰羥酸還原酶（ILV5基因編碼）、二羥基酸脫水酶（ILV3基因編碼）、2-異丙基蘋果酸合酶（LEU4或LEU9基因編碼）、異丙基蘋果酸異構(gòu)酶（LEU1基因編碼）和2-異丙基蘋果酸脫氫酶（由LEU2基因編碼）共同作用；下游途徑（從KIC到異戊醇）由α-酮酸脫羧酶（KDCs）和乙醇脫氫酶（ADHs）催化。YUAN等[16]發(fā)現(xiàn)將亮氨酸生物合成途徑整合到酵母染色體上后異戊醇稍有提高，繼續(xù)過度表達(dá)OAC1（α-IPM轉(zhuǎn)運(yùn)體）基因后異戊醇產(chǎn)量有了明顯的增強(qiáng)，這表明過表達(dá)OAC1基因可以使α-IPM更為有效地運(yùn)出線粒體膜，從而提高異戊醇的產(chǎn)量。SUNG等[17]研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中敲除BAT1、BAT2這兩個(gè)基因并沒有導(dǎo)致異戊醇減少，并且在添加L-亮氨酸之前就能檢測到異戊醇，表明異戊醇主要是由糖代謝途徑生成的。ILV基因負(fù)責(zé)上游途徑中α-酮異戊酸的合成，它的表達(dá)將影響到異戊醇的產(chǎn)量。有研究者發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中敲除ILV1基因后可使ILV2、ILV5及ILV3基因的表達(dá)水平顯著增加，加強(qiáng)了異戊醇生物合成的前體α-酮異戊酸的生物合成，從而引起異戊醇產(chǎn)量的增加，而酵母中LEU1或LEU2基因的敲除減少了α-酮異己酸的生物合成，所以降低了異戊醇的產(chǎn)量[18]。

2.4 苯乙醇途徑及關(guān)鍵基因

酵母可以利用芳香族氨基酸作為唯一的氮源，通過Ehrlich途徑合成2-苯乙醇（2-phenyl ethanol，2-PE），這是釀酒酵母合成2-PE的主要途徑，包括3個(gè)步驟。首先是L-苯丙氨酸（L-Phe）在兩種氨基酸轉(zhuǎn)氨同功酶（ARO8和ARO9基因編碼）的催化下轉(zhuǎn)化成苯丙酮酸，隨后苯丙酮酸在苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）催化下生成苯乙醛。最后苯乙醛還原為2-苯乙醇，5 種醇脫氫酶基因 ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5均能催化這一反應(yīng)[19]。

苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）、氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（ARO8和ARO9基因編碼）、鋅簇轉(zhuǎn)錄激活劑CAT8、DNA結(jié)合蛋白MIG1，鋅指轉(zhuǎn)錄激活子ARO80參與了2-苯乙醇的生物合成，其中，ARO80可以通過與ARO9和ARO10啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合激活A(yù)RO9和ARO10基因的表達(dá)；LEE等[20]研究發(fā)現(xiàn)ARO80和GATA因子在ARO9、ARO10和ARO80基因表達(dá)中的相互作用；GATA轉(zhuǎn)錄因子Gln3p和Gat1p調(diào)控滲透酶基因和分解代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄，它們不僅能促進(jìn)底物有效進(jìn)入細(xì)胞，還能通過直接激活A(yù)RO9和ARO10來增強(qiáng)芳香轉(zhuǎn)氨酶和苯丙酮酸脫羧酶的活性，因此GAT1與GLN3基因的過表達(dá)都可使2-PE合成得到顯著加強(qiáng)[21]；一般氨基酸滲透酶基因GAP1負(fù)責(zé)芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，過表達(dá)GAP1可促進(jìn)底物L(fēng)-Phe的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高2-PE的產(chǎn)量。CAT8和MIG1是與碳代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，WANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)在敲除MIG1后CAT8表達(dá)與2-PE的含量都有了提升，這可能是MIG1參與了CAT8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，MIG1缺失促進(jìn)CAT8的表達(dá)，CAT8的高效表達(dá)又上調(diào)了ARO9和ARO10基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而增強(qiáng)了2-PE的產(chǎn)生。

2.5 高級(jí)醇合成下游途徑關(guān)鍵酶（KDCs與ADHs）

在釀酒酵母中，由糖代謝或氨基酸分解而來得α-酮酸需經(jīng)α-酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶先后作用后才能生成高級(jí)醇。而釀酒酵母中有5種類似KDC的酶和6種乙醇脫氫酶（ADHs），通常分別由 PDC1、PDC5、PDC6、YDL080C/THI3、YDR380w/ARO10 與 ADH1、ADH2、ADH5、ADH6、ADH7、Sfa1 基因編碼。

丙酮酸是釀酒酵母中一個(gè)非常重要的化合物，一方面，它可以經(jīng)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶先后作用生成乙醇，另一方面，它也可以在一系列酶的作用下生成高級(jí)醇。丙酮酸脫羧酶（PDC1、PDC5、PDC6基因編碼）位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，主要負(fù)責(zé)催化丙酮酸的脫羧，所以它們的表達(dá)可以決定丙酮酸的流向，進(jìn)而影響高級(jí)醇的生成。ZHANG等[23]研究表明，單敲除PDC1、PDC5、PDC6基因均可提高異丁醇產(chǎn)量，原因是由于敲除PDC基因后，丙酮酸生成乙醇途徑受阻，迫使它流向高級(jí)醇代謝途徑，從而提高了異丁醇產(chǎn)量，敲除PDC6基因的菌株中乙醇含量降低也進(jìn)一步驗(yàn)證了這點(diǎn)。同時(shí)，LI等[24]研究發(fā)現(xiàn)PDC5基因的敲除是提高釀酒酵母異丁醇產(chǎn)量的主要因素之一，并且過表達(dá)ILV2和ARO10基因的同時(shí)敲除PDC5基因可導(dǎo)致異丁醇產(chǎn)量比對(duì)照菌株高8倍。李楊等[25]通過過表達(dá)ILV2、ILV3、BAT2基因的同時(shí)敲除PDC6基因?qū)⒈岷铣梢掖挤较虻拇x通量轉(zhuǎn)向合成異丁醇的方向上，使乙醇的產(chǎn)率降低，而異丁醇的產(chǎn)率提高了11.4倍。

類丙酮酸脫羧酶（YDL080C基因編碼）與苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）主要負(fù)責(zé)α-酮酸的脫羧，而此反應(yīng)在各種高級(jí)醇生成中又稍有不同。有研究報(bào)道，在異戊醇合成過程中，α-酮異己酸脫羧主要由YDL080C、ARO10基因負(fù)責(zé)，在纈氨酸分解異戊醇的代謝中，丙酮酸脫羧酶（PDC1、PDC5、PDC6 基因編碼）中任意一種同工酶都可以將α-酮異戊酸脫羧成醛，而在活性戊醇的合成中，這5種酶中的任何一種都可以將α-酮-3-甲基戊酸脫羧[26]。苯丙酮酸脫羧酶（ARO10基因編碼）是一種具有廣泛底物特異性的脫羧酶，其活性依賴于酵母生在長過程中所使用的氮源[27]。當(dāng)苯丙氨酸為唯一的氮源時(shí)，它的轉(zhuǎn)錄水平可增加30倍，且足以使苯丙酮酸脫羧[28]。

α-酮酸在脫羧成醛后還需經(jīng)乙醇脫氫酶作用后才能生成高級(jí)醇，SHEN等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與過表達(dá)ARO10基因相比，單獨(dú)過表達(dá)ADH基因?qū)?-PE的產(chǎn)生沒有明顯的影響。然而，當(dāng)ADH1、ADH2或ADH5基因與ARO10基因共同表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致2-PE明顯增加。同時(shí)，KONDO等[30]也指出，當(dāng)ADHs與來自乳球菌的脫羧酶KIVD在釀酒酵母中共表達(dá)時(shí)，ADH2和ADH5基因過表達(dá)可使異丁醇生產(chǎn)水平稍有增加、SFA1和ADH1基因過表達(dá)則對(duì)異丁醇的生產(chǎn)沒有影響、而ADH6和ADH7基因的過表達(dá)可使異丁醇顯著增加。

3 低產(chǎn)高級(jí)醇菌株的選育方法

啤酒酵母通常是由雜交而來的異源多倍體，不同品種的啤酒酵母由于其生理特性差異，即使采用相同發(fā)酵工藝，高級(jí)醇產(chǎn)量也大有不同。啤酒中高級(jí)醇含量普遍過高，想要將高級(jí)醇含量控制在合理范圍內(nèi)，選育低產(chǎn)高級(jí)醇的優(yōu)良酵母菌株是最根本的方法。目前，原生質(zhì)體融合育種、誘變育種及基因工程育種是菌種選育最常用的方法。

3.1 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合技術(shù)又稱細(xì)胞融合技術(shù)，是指兩種不同的親株用酶法去壁后，得到的原生質(zhì)體置于高滲溶液中，在一定融合劑的促融作用下使兩者相互凝集并發(fā)生細(xì)胞之間的融合，進(jìn)而導(dǎo)致基因重組獲得新菌株的育種方法[31]。蔡車國等[32]以發(fā)酵度較高的非絮凝性的啤酒酵母菌株和發(fā)酵度較低、絮凝性較強(qiáng)的啤酒酵母菌株為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合得到一株需酪素水解物的營養(yǎng)缺陷型菌株。該菌株經(jīng)優(yōu)化和原生質(zhì)體融合后得到一株絮凝性較強(qiáng)且總高級(jí)醇含量顯著降低的優(yōu)良菌株。王芬等[33]以紫外線滅活的菌株JW1-1（雙乙酰、總高級(jí)醇的含量較低，但發(fā)酵度較低）原生質(zhì)體和熱滅活的菌株NW7-45（雙乙酰、總高級(jí)醇的含量較高，發(fā)酵度較高）原生質(zhì)體為親本進(jìn)行融合。經(jīng)篩選得到了發(fā)酵度為69.5%，雙乙酰，乙醛和總高級(jí)醇的含量適中的優(yōu)良菌株。

3.2 誘變育種

誘變是指采用物理、化學(xué)因素誘發(fā)機(jī)體發(fā)生遺傳性變異，并經(jīng)過篩選，鑒定從而獲得新品種的方法。紫外誘變、微波誘變、室溫常壓等離子體（atmospheric room temperture plasma，ARTP）誘變育種是酵母常用的育種方法。SHEN等[34]利用紫外誘變技術(shù)，并經(jīng)長期馴化后獲得了產(chǎn)高級(jí)醇與酯的比例低于對(duì)照菌株的突變株D-A-14。朱莉娜[35]等采用微波誘變技術(shù)對(duì)啤酒酵母進(jìn)行誘變處理，經(jīng)過乳酸培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖-碳酸鈣培養(yǎng)基、氯化三苯基四氮唑顯色培養(yǎng)基等一系列鑒別培養(yǎng)基初篩后進(jìn)行啤酒發(fā)酵復(fù)篩，得到7株高級(jí)醇產(chǎn)量降低的菌株。室溫常壓等離子體（ARTP）是一種新型全細(xì)胞誘變工具，其突變率高于紫外輻射或化學(xué)誘變劑，且處理溫度較低，非常適用于酵母菌株的誘變。王國正等[36]運(yùn)用常溫常壓等離子體誘變技術(shù)篩選得到了一株高級(jí)醇產(chǎn)量降低20%的釀酒酵母菌株ARTP5，并且通過與原始菌株CF4胞內(nèi)蛋白組差異相比，發(fā)現(xiàn)誘變菌株ARTP5的ADH1蛋白表達(dá)被下調(diào)，這可能是導(dǎo)致ARTP菌株產(chǎn)高級(jí)醇降低的原因之一。

3.3 基因工程育種

在過去的幾十年里，隨著分子學(xué)微生物的興起，基因工程的合理運(yùn)用已經(jīng)成為遺傳育種首選的方法。所謂的基因工程是指把某種生物的個(gè)別基因復(fù)制出來，經(jīng)改造加工后放到另一個(gè)生物里面，定向的改變生物的遺傳性狀，從而獲得人們想要的物種的一種技術(shù)。為了探究BAT基因表達(dá)對(duì)酵母風(fēng)味化合物影響，LILLY等[37]構(gòu)建了BAT2/BAT1基因缺失突變株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)基因的缺失都可以使異丁醇、異戊醇產(chǎn)量下降。石鈺等[38]運(yùn)用同源重組技術(shù)構(gòu)建了LEU1基因缺失的菌株，該菌株與出發(fā)菌株發(fā)酵試驗(yàn)表明，突變株在降低異戊醇含量的同時(shí)提升了正丙醇和異丁醇的產(chǎn)量；ZHENG等[39]采用無痕敲除技術(shù)在BAT2基因位點(diǎn)過表達(dá)ALD6基因而構(gòu)建了不含任何外源基因和外源 DNA 片段的菌株 （HJΔB-AG、HJΔB-AP 和HJΔB-AC），這些菌株產(chǎn)生的高級(jí)醇濃度分別降低了39.91%、45.55%和52.80%，且可以安全地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)之中；同時(shí)，LI等[40]以I-SCEI內(nèi)切酶為DNA雙鍵斷裂（DNA strand breaks，DSB）誘導(dǎo)劑，采用兩步整合技術(shù)構(gòu)建了BAT2缺失和ATF1過表達(dá)的菌株。該突變株對(duì)高級(jí)醇的降低和酯的提高有明顯的效果。

4 結(jié)論與展望

20世紀(jì)初期已有研究者開始研究高級(jí)醇，經(jīng)過100多年的研究，已經(jīng)在碳源和氮源如何調(diào)控高級(jí)醇方面取得了不少進(jìn)展，并且隨著基因工程的興起，高級(jí)醇在代謝通路，關(guān)鍵調(diào)控因子方面已愈發(fā)明朗，該文以啤酒酵母為研究對(duì)象，對(duì)其高級(jí)醇的合成途徑、關(guān)鍵調(diào)控基因（BAT2、BAT1、BAP2、ILV、LEU、PDC、ARO、ADH、YDL080C）及菌種選育手段進(jìn)行重點(diǎn)描述，為適當(dāng)?shù)目刂聘呒?jí)醇含量提供指導(dǎo)。

近年來人們主要從菌種的選育和發(fā)酵工藝兩方面對(duì)啤酒中高級(jí)醇進(jìn)行控制，利用基因工程與誘變技術(shù)均可獲得低產(chǎn)高級(jí)醇的菌株，并且基因工程育種已實(shí)現(xiàn)了無痕改造，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中已不包含任何外源基因和DNA片段，克服了不少安全隱患，未來有很好的應(yīng)用前景，為此，還需繼續(xù)深入研究基因與代謝通路，使基因工程菌更加廣泛的運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)中。