劉敏 李明俊 余慶 何坤 吳玉珊 楊紅紅 李同心

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的一大類(lèi)分枝桿菌的總稱(chēng)。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)NTM菌種190余種，14個(gè)亞種，其中大部分為寄生菌，僅少部分對(duì)人體致病，為條件致病菌[1-3]。近年來(lái)，NTM感染率呈快速上升趨勢(shì)，可引起肺部、皮膚、軟組織、骨關(guān)節(jié)、淋巴結(jié)等部位感染，尤其是對(duì)于免疫功能低下的人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者，并發(fā)NTM感染率較高，且易被誤診為MTB感染。有研究顯示，在廣西、上海等地區(qū)HIV感染者的分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中約50%為NTM感染[4-6]。但不同地區(qū)由于自然環(huán)境及人群生活習(xí)慣等差異，導(dǎo)致HIV并發(fā)NTM感染的發(fā)生率不同，且NTM菌種分布及耐藥情況亦有所差異。為進(jìn)一步了解重慶市HIV與NTM雙重感染患者的臨床特征及NTM的耐藥情況，本研究收集重慶市HIV與NTM雙重感染患者的臨床資料，分析NTM菌種構(gòu)成及耐藥情況，以指導(dǎo)臨床合理診療。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

收集2019年6月至2020年6月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心感染科明確診斷為HIV與NTM雙重感染的44例患者，占同期收治HIV并發(fā)所有分枝桿菌感染患者的23.8%(44/185)。HIV感染的診斷參考2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)艾滋病學(xué)組制定的《中國(guó)艾滋病診療指南(2018版)》[7]。NTM感染的診斷參考2019年《人類(lèi)免疫缺陷病毒/艾滋病患者合并非結(jié)核分枝桿菌感染診治專(zhuān)家共識(shí)》[8]。

二、研究方法

回顧性收集所有研究對(duì)象的臨床資料(基本信息、臨床癥狀、檢測(cè)指標(biāo)等)。計(jì)算NTM菌種的耐藥發(fā)生情況。分枝桿菌菌種鑒定檢測(cè)試劑盒由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)，可以鑒定22種分枝桿菌，分別為恥垢分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、次要分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胃分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌、母牛分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種、蘇爾加分枝桿菌、海/潰瘍分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、偶發(fā)/豬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、戈登分枝桿菌。

NTM藥物敏感性(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏”)試驗(yàn)(微孔板)使用的試劑盒由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)。操作方法：(1)取出凍干雜菌抑制劑和稀釋液，將稀釋液加入凍干粉，充分混勻。(2)取出液體藥敏培養(yǎng)基和藥敏測(cè)試板，恢復(fù)至室溫。吸取200 μl雜菌抑制劑加入液體藥敏培養(yǎng)基，充分混勻。(3)用一次性接種環(huán)挑取待測(cè)菌株新鮮菌落，移至專(zhuān)用比濁管，將比濁管放入自動(dòng)超聲分散儀進(jìn)行磨菌比濁至1 mg/ml，靜置5～10 min后取200 μl 1 mg/ml的均勻細(xì)菌上清至已加入雜菌抑制劑的液體藥敏培養(yǎng)基，充分混勻。(4)打開(kāi)YK96自動(dòng)移液平臺(tái)，將已加細(xì)菌的培養(yǎng)基、空白培養(yǎng)基和藥敏測(cè)試板放入平臺(tái)指定空位，運(yùn)行“96孔”加樣模式。(5)待加樣完畢，蓋上微孔板蓋子，用膠條封閉板條空隙，置37 ℃生化孵育箱培養(yǎng)。(6)結(jié)果判斷：第3～7天觀(guān)察結(jié)果，孔底出現(xiàn)白色菌體沉淀的為陽(yáng)性，無(wú)菌體沉淀的為陰性。陰性孔于第10天再觀(guān)察一次結(jié)果。最低抑菌濃度(MIC)為無(wú)白色沉淀的96微孔對(duì)應(yīng)的最小藥物濃度。當(dāng)難以判定MIC孔時(shí)，可將該孔與“1/10參照孔”作比較，如果該孔沉淀菌體小于“1/10參照孔”沉淀，即可判定生長(zhǎng)被抑制。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般情況及臨床特征

44例HIV與NTM雙重感染患者年齡范圍24～69歲，平均年齡(47.1±12.8)歲；其中19例(43.2%)有吸煙史，7例(15.9%)既往有肺結(jié)核病史?；颊呷朐簳r(shí)主要臨床表現(xiàn)有咳嗽、咳痰、發(fā)熱、氣促癥狀，發(fā)熱以中低熱為主，見(jiàn)表1。分離出NTM的標(biāo)本來(lái)源分別為：痰液38份(86.4%)、血液4份(9.1%)、腦脊液1份(2.3%)、淺表包塊分泌物1份(2.3%)、尿液1份(2.3%)，其中1例患者痰液及血液中均發(fā)現(xiàn)NTM。實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)44例患者中34例(77.3%)存在不同程度貧血，血紅蛋白中位數(shù)為101.0 g/L(正常值范圍：130～175 g/L)，白細(xì)胞及血小板均值均處于正常范圍(白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常范圍：3.5×109/L～9.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)正常范圍：125×109/L～350×109/L)，29例(65.9%)C反應(yīng)蛋白(CRP)升高，中位數(shù)為32.3 mg/L(正常值范圍：0～10 mg/L)，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)44個(gè)/μl(正常值范圍：414～1123個(gè)/μl)，其中低于200個(gè)/μl 者40例(90.9%)。44例患者中9例(20.5%)初始治療方案給予抗NTM方案治療(方案中包含乙胺丁醇、利福布汀、左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素)，24例(54.5%)初始給予常規(guī)抗結(jié)核方案治療(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星)，11例(25.0%)由于臨床癥狀輕，住院時(shí)間較短，出院時(shí)抗酸桿菌培養(yǎng)結(jié)果尚未報(bào)告，故住院期間未啟動(dòng)抗分枝桿菌治療。后續(xù)隨訪(fǎng)過(guò)程中結(jié)合持續(xù)存在的臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)等指標(biāo)綜合評(píng)估后，全部給予抗NTM治療。

表1 44例HIV與NTM雙重感染患者一般資料

二、NTM菌種鑒定結(jié)果

44株NTM菌株經(jīng)PCR-反向點(diǎn)雜交法鑒定，共明確鑒定出8種NTM菌種，有2例菌株抗酸染色為陽(yáng)性，超出本研究采用的菌種鑒定試劑盒鑒定范圍，未能明確鑒定出菌種。結(jié)果顯示，HIV感染者中鳥(niǎo)分枝桿菌占比最多(34.1%)，其次為胞內(nèi)分枝桿菌(20.4%)，偶發(fā)/豬分枝桿菌及堪薩斯分枝桿菌各有5株(11.4%)，見(jiàn)表2。

表2 44株NTM菌種分布情況

三、NTM藥敏試驗(yàn)結(jié)果

44株NTM菌株均完成表3中第1～8種藥物的藥敏試驗(yàn)，其中21例患者同時(shí)完成第9～15種藥物的藥敏試驗(yàn)，28例患者同時(shí)完成第16～22種藥物的藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，44例患者NTM耐藥率高，對(duì)常用的抗結(jié)核藥物異煙肼、對(duì)氨基水楊酸異煙肼、利福平的耐藥率分別高達(dá)81.8%、75.0%、45.5%，對(duì)阿奇霉素耐藥率亦高達(dá)61.9%。耐藥率較低的藥物有利福布汀和克拉霉素，分別為6.8%和11.4%，氯法齊明、阿米卡星耐藥率也相對(duì)較低，但均接近30%。菌種分布中占比最高的鳥(niǎo)分枝桿菌耐藥形勢(shì)較為嚴(yán)峻，見(jiàn)表3。

表3 不同藥品在不同NTM菌株中的耐藥情況

討 論

HIV感染者免疫力低下，相較于非HIV感染人群，更容易感染NTM；在部分發(fā)達(dá)國(guó)家甚至超過(guò)了MTB感染率[9]。本研究中心為重慶市唯一一家集中收治艾滋病患者的三級(jí)傳染病專(zhuān)科醫(yī)院，研究結(jié)果具有一定的代表性。結(jié)果顯示，重慶市HIV感染者中分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本NTM占23.8%，需臨床醫(yī)師高度警惕。本研究結(jié)果還顯示，HIV與NTM雙重感染患者臨床表現(xiàn)與MTB相似，缺乏特異性，且超過(guò)15%的患者既往有MTB感染史，臨床易被誤診為MTB，僅20.5%的患者初始治療方案給予抗NTM治療。故在選擇治療方案前需盡可能尋找病原學(xué)依據(jù)明確診斷，或者在抗結(jié)核試驗(yàn)性治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)治療效果不佳時(shí)，亦需警惕是否為NTM感染。NTM可侵犯人體多部位多系統(tǒng)，本研究中15.9%的培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果來(lái)源于非痰液標(biāo)本。故針對(duì)不同患者，應(yīng)留取多部位標(biāo)本，同時(shí)運(yùn)用多種檢查方法(抗酸桿菌涂片、PCR、分枝桿菌培養(yǎng))查找病原菌，而非局限于痰液標(biāo)本，以提高培養(yǎng)陽(yáng)性率。若同一例患者抗酸桿菌涂片陽(yáng)性，而結(jié)核DNA或RNA檢測(cè)顯示陰性時(shí)，亦需警惕是否為NTM感染。

鳥(niǎo)分枝桿菌是HIV與NTM雙重感染患者NTM感染菌株中最常見(jiàn)的菌種[10]。上海、廣西等地HIV與NTM雙重感染患者中鳥(niǎo)分枝桿菌占比為43.3%～54.0%[4-5]。本研究結(jié)果顯示，重慶市NTM感染患者中鳥(niǎo)分枝桿菌亦為最常見(jiàn)菌種(34.1%)，占比低于上海、廣西等地[4-6]，高于非洲西部地區(qū)(23.7%)[11]，考慮與氣候環(huán)境等因素相關(guān)。張匯征等[12]2019年進(jìn)行的研究顯示，重慶市非HIV感染人群并發(fā)NTM感染菌株中以膿腫分枝桿菌為主(39.5%)，其次為胞內(nèi)分枝桿菌(34.9%)，而鳥(niǎo)分枝桿菌僅占7.0%。可見(jiàn)，不同特征人群NTM檢出率存在差異，且檢出的NTM菌種構(gòu)成比亦有明顯差異，考慮系人群免疫功能差異所致。

NTM耐藥率極高，大多數(shù)NTM感染者對(duì)抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性[13]。賈彤等[14]研究顯示，較常見(jiàn)的NTM對(duì)常用的一線(xiàn)抗結(jié)核藥物如異煙肼、利福平普遍耐藥，耐藥率近100%。秦中華等[15]的研究顯示，NTM對(duì)二線(xiàn)抗結(jié)核藥物如卡那霉素、氧氟沙星的耐藥率亦分別高達(dá)80.6%和68.1%。有研究顯示，HIV與NTM雙重感染患者病死率高達(dá)29%[16-17]。本研究顯示，重慶市HIV與NTM雙重感染患者對(duì)異煙肼、對(duì)氨基水楊酸異煙肼、阿奇霉素、利福平的總體耐藥率分別高達(dá)81.8%、75.0%、61.9%、45.5%，可供選擇藥物種類(lèi)有限。耐藥率相對(duì)較低的藥物有利福布汀、克拉霉素，其次為丙硫異煙胺、氯法齊明、阿米卡星。需特別指出的是，本結(jié)果顯示HIV并發(fā)鳥(niǎo)分枝桿菌感染者對(duì)丙硫異煙胺的耐藥率高達(dá)100%，該結(jié)果有別于廣東地區(qū)HIV并發(fā)鳥(niǎo)分枝桿菌感染對(duì)丙硫異煙胺的耐藥率(7.1%)[14]，亦有別于重慶市非HIV感染者出現(xiàn)鳥(niǎo)分枝桿菌感染時(shí)對(duì)丙硫異煙胺的耐藥率(33.2%)[13]。因此，對(duì)于HIV與NTM雙重感染患者，有必要行NTM菌種鑒定及耐藥檢測(cè)，以便指導(dǎo)下一步治療，不能簡(jiǎn)單套用不同省市、不同特征人群NTM藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇治療方案。針對(duì)無(wú)法行菌種鑒定及耐藥檢測(cè)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，可參考當(dāng)?shù)叵嗤卣魅巳旱腘TM耐藥報(bào)告給予經(jīng)驗(yàn)性治療，治療過(guò)程中注意抗NTM藥物與抗HIV藥物間的相互作用。

總之，由于HIV感染者免疫功能低下，易并發(fā)NTM感染，以鳥(niǎo)分枝桿菌及胞內(nèi)分枝桿菌為主。該群體NTM耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，在診療過(guò)程中需高度警惕，對(duì)HIV感染者進(jìn)行準(zhǔn)確的分枝桿菌菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)對(duì)臨床診治具有重要意義。本研究分析亦存在不足，如44例NTM感染患者并非全部完成22種藥物的藥敏試驗(yàn)，且總體樣本量偏少，有待收集更大樣本更深入地明確重慶市HIV與NTM雙重感染的現(xiàn)狀及療效。