王波 周蘭英 夏華梅

摘要：探究大白杜鵑花粉萌發(fā)所需的營養(yǎng)液濃度組合，為大白杜鵑的資源保存及雜交育種提供科學依據(jù)。以大白杜鵑新鮮花粉為試驗材料，利用單因子試驗比較固體培養(yǎng)基中不同濃度的蔗糖、硼酸、Ca2+對其萌發(fā)的影響，在此基礎上進行正交試驗，探討大白杜鵑花粉萌發(fā)的最佳蔗糖、硼酸、Ca2+濃度組合。結果表明，在一定質量濃度范圍內，蔗糖、硼酸、Ca2+對大白杜鵑花粉萌發(fā)均起到促進作用，但是超過一定質量濃度時則起抑制作用，最適濃度分別為10%、0005%、0.002%。蔗糖、硼酸和Ca2+這3個因素的綜合作用對大白杜鵑花粉萌發(fā)有顯著影響，大白杜鵑花粉的最適培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002%Ca2+。

關鍵詞：大白杜鵑;花粉;萌發(fā);培養(yǎng)基

大白杜鵑（Rhododendron decorum Franch.），別稱大白花杜鵑，是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron L.）木本植物，在我國主要分布在四川、云南、貴州、西藏等地，在四川省會理縣生長于龍肘山海拔1 900～2 100 m處，種群成片分布。大白杜鵑花簇多花，形如繡球，色澤艷麗;是杜鵑花中少有的香花品種，具有很高的觀賞價值;分布廣泛、海拔較低，是香花育種的理想親本。張敬麗等研究發(fā)現(xiàn)，馬纓花（Rhododendron delavayi Franch.）與大白花杜鵑進行雜交后，雜交種能夠結出可育的種子[1]。此外，大白杜鵑還可供食用和藥用[2-3]，開發(fā)利用前景廣闊。但是，人為干預使其生境遭到嚴重破壞，資源日趨受到威脅，環(huán)境干旱使野生杜鵑結實率降低[4]，大白杜鵑物種資源的保存迫在眉睫。

目前，國內外對大白杜鵑的研究主要集中在生態(tài)分布、染色質組成[5]、營養(yǎng)成分[2]和組織培養(yǎng)[6]等方面，有關大白杜鵑花粉的儲存及其生活力、萌發(fā)條件的研究未見報道。目前已有少數(shù)其他杜鵑種花粉的研究，如徐芬芬等對毛杜鵑（Rhododendron pulchrum）花粉離體萌發(fā)特性的研究發(fā)現(xiàn)，毛杜鵑花粉萌發(fā)的最適硼酸質量濃度為10 mg/L，培養(yǎng)7 h后花粉萌發(fā)情況穩(wěn)定[7]。李玉萍等以滿山紅、映山紅、馬銀花、錦繡杜鵑的新鮮花粉為試驗材料，測定不同液體培養(yǎng)基和儲藏方法下的花粉萌發(fā)力，發(fā)現(xiàn)杜鵑花花粉的適宜培養(yǎng)基配方為100 g/L蔗糖+20 mg/L 硼酸+20 mg/L CaCl2[8]。目前，關于其他植物花粉萌發(fā)的研究非常多，不同植物花粉萌發(fā)要求的最適培養(yǎng)基組合和濃度不同，但適量的蔗糖、硼酸、CaCl2會提高多數(shù)植物花粉的萌發(fā)率。目前，關于大白杜鵑花粉萌發(fā)的研究未見報道，本試驗用蔗糖、硼酸及CaCl2 3個因素組成的固體培養(yǎng)基研究大白杜鵑花粉的萌發(fā)力，旨在找出適合大白杜鵑花粉萌發(fā)的營養(yǎng)液濃度組合，為大白杜鵑的資源保存及雜交育種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料于2013年5月9日采自四川省會理縣龍肘山海拔1 900～2 100 m處。選擇20株盛花期大白杜鵑植株上即將開放的100朵花，用濕毛巾包裹后放入裝有冰塊的潔凈紙盒內冷藏并迅速帶回實驗室，任其花藥自然開裂，收集花粉，并將花粉充分混勻，避免個體植株花藥不同引起的花粉生活力差異。將收集的花粉裝入花粉瓶中，于 4 ℃ 低溫冷藏。

1.2 培養(yǎng)基配方和制作方法

單因素試驗中各因素濃度水平[9-10]如表1所示，以同樣濃度的空白培養(yǎng)基作為對照。在進行單因素試驗后，總結分析各因素濃度對花粉萌發(fā)的影響，并在此基礎上進行L16（43）正交試驗。按濃度配方配制100 mL溶液，加入搪瓷碗中，煮沸后向其中加入1 g瓊脂粉，攪拌至充分溶解，冷卻后作為花粉接種用固體培養(yǎng)基。

1.3 花粉培養(yǎng)觀測方法

在雙孔凹型玻片孔內滴1滴清水以保持濕度，在蓋玻片上滴入適量培養(yǎng)基，將花粉均勻播種在培養(yǎng)基上，再將有培養(yǎng)基的一面朝下蓋在玻片孔上，每個培養(yǎng)基設5個重復。將玻片放入25 ℃人工培養(yǎng)箱中，在黑暗條件下培養(yǎng)。每隔2 h觀測1次，發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)后，每隔1 h觀測1次，最終從2次測定萌發(fā)率基本相同開始測定萌發(fā)率。大白杜鵑花粉為四合體，單粒花粉為圓球形[11-12]，在統(tǒng)計花粉萌發(fā)數(shù)時，只要有1個花粉萌發(fā)即視為萌發(fā)，以花粉管長度超過花粉直徑作為判斷萌發(fā)的標準。每個玻片觀察5個視野，每個視野觀察的花粉數(shù)不少于30粒，記錄花粉的萌發(fā)數(shù)量，花粉萌發(fā)率的計算公式如下：

花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/測定的花粉粒總數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，并用SPSS軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行單因變量多因素方差分析，若差異顯著，則在方差分析的基礎上用新復極差法（SSR）進行因素水平間的多重比較。

2 結果與分析

2.1 大白杜鵑花粉萌發(fā)的基本情況

將大白杜鵑花粉于25 ℃黑暗條件下處理3 h后，四合體吸水膨大，極面觀為三裂球形;6 h后花粉管從寬大的萌發(fā)溝內長出，并逐漸增長;10 h后萌發(fā)基本趨于穩(wěn)定，花粉管的長度達到最長。在按試驗對照條件處理12 h后，花粉的萌發(fā)效果見圖1。

2.2 單因素試驗中不同濃度蔗糖、硼酸、CaCl2對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響

2.2.1 蔗糖對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響 由圖2可知，不同濃度蔗糖對大白杜鵑花粉萌發(fā)有不同程度的影響。當蔗糖濃度為0、2%、5%、10%時，花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的升高而提高，分別為688%、20.77%、54.91%、74.23%，最大萌發(fā)率為74.23%;但當蔗糖濃度超過10%以后，花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的增加而下降。綜上，大白杜鵑花粉萌發(fā)的適宜蔗糖濃度為10%。

2.2.2 硼酸對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響 由圖3可知，不同濃度硼酸對大白杜鵑花粉萌發(fā)有不同程度的影響。當硼酸濃度為0～0.005%時，花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的升高而提高，最大萌發(fā)率為5757%;但當硼酸濃度超過0.005%以后，花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的增加而下降。綜上，大白杜鵑花粉萌發(fā)的適宜硼酸濃度為0.005%。

2.2.3 CaCl2對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響 由圖4可知，不同濃度CaCl2對大白杜鵑花粉萌發(fā)有不同程度的影響。當CaCl2濃度為0～0.002%時，花粉萌發(fā)率隨著CaCl2濃度的升高而提高，最大萌發(fā)率為39.47%; 但當CaCl2濃度超過0.002%以后， 花粉萌發(fā)率隨著CaCl2濃度的增加而下降。綜上，大白杜鵑花粉萌發(fā)的適宜CaCl2濃度為0.002%，并且高濃度的CaCl2會明顯抑制大白杜鵑的花粉萌發(fā)。

2.3 正交試驗結果分析

單因素試驗結果表明，對照條件下大白杜鵑花粉有少量萌發(fā)，表明外源因素不是萌發(fā)的必要因素。如表2所示，大白杜鵑花粉在10%蔗糖+0005%硼酸+0.001%CaCl2培養(yǎng)基配方下的萌發(fā)率最高，達到86.69%。極差分析結果顯示，對花粉萌發(fā)率影響的因素排序為蔗糖、硼酸、CaCl2，極差依次為167.74、135.26、58.06，相應的較優(yōu)水平分別為A3（10%）、B3（0.005%）、C2（0.002%），由較優(yōu)水平組合而成的最佳培養(yǎng)基配方為10%蔗糖+0005%硼酸+0.002%CaCl2，與單因素試驗得出的正交試驗結果最高的萌發(fā)率培養(yǎng)基配方一致。正交試驗結果表明，蔗糖、硼酸和CaCl2在一定濃度范圍內共同作用時對大白杜鵑花粉的萌發(fā)有一定促進作用;大白杜鵑花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基配方為10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002%CaCl2。

3 結論與討論

很多研究發(fā)現(xiàn)，植物花粉離體萌發(fā)的影響因素很多，內因包括供體植株基因型、發(fā)育時期、花粉生活力等，外因如培養(yǎng)基固液形態(tài)、瓊脂濃度、培養(yǎng)溫度和濕度、光照條件、培養(yǎng)基營養(yǎng)種類和濃度等[13]，其中蔗糖、硼酸及一些礦質元素如外源Ca2+等的參與是比較重要的，是誘導離體花粉萌發(fā)的基本條件。在本試驗中，對照處理的花粉也具有一定的萌發(fā)率，由此或可大膽推測，花粉可能本身就含有少量蔗糖、硼酸及Ca2+。目前已知，細胞壁是植物細胞最大的鈣庫，用X射線分析鈣在花粉粒中的分布結果也顯示，多數(shù)植物花粉壁上含有少量鈣[14]。

一般認為，蔗糖在花粉萌發(fā)過程中的作用有2個，一是為花粉萌發(fā)和花粉管的生長提供能源和碳源，二是調節(jié)培養(yǎng)環(huán)境滲透壓[15-16]。試驗中一定濃度的蔗糖促進大白杜鵑花粉萌發(fā)，最適宜的蔗糖濃度為10%，當蔗糖濃度過高時，花粉萌發(fā)率開始下降，這與徐芬芬等的研究結果[17]相似。這有可能是因為適當濃度的蔗糖能維持花粉與培養(yǎng)基之間的滲透平衡，而過高的蔗糖濃度則會導致花粉管破裂產生質壁分離現(xiàn)象，從而造成原生質體脫水，抑制花粉萌發(fā)生長，降低萌發(fā)率[18-19]。

目前許多研究發(fā)現(xiàn)，硼作為植物必需的微量元素，在花粉萌發(fā)和花粉管伸長中的主要作用是增加糖的吸收、運轉和代謝，以增強花粉管壁的可塑性[20]。在離體條件下，補充一定量的外源硼，可以大大提高其花粉萌發(fā)率。在本試驗中，提高硼酸濃度顯著提高了花粉萌發(fā)率，當硼酸濃度為0.005%時，大白杜鵑花粉的萌發(fā)率最高。

鈣離子在生物體的電化學震蕩理論中被稱為細胞中調節(jié)的“第二信使”，鈣離子水平受到環(huán)境中鈣含量和植物自身鈣受體的影響，從而引起一系列生長發(fā)育過程。在花粉的離體培養(yǎng)過程中，Ca2+可以通過多種途徑影響花粉萌發(fā)和花粉管的生長，其中涉及細胞骨架的組裝、分泌小泡的運輸和融合、花粉管頂端的脈沖式生長、花粉管生長方向調控等各個方面[21-24]。許多研究發(fā)現(xiàn)，外源鈣對花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用取決于細胞內游離鈣的含量，即在細胞內游離鈣充足或已充分吸收外源鈣時，外源鈣對花粉萌發(fā)和花粉管生長就可能起抑制作用，反之則起促進作用。本試驗中單因素Ca2+濃度明顯影響大白杜鵑花粉萌發(fā)，表明一定程度的外源鈣能促進大白杜鵑花粉萌發(fā)和花粉管生長，當Ca2+濃度為0.002%時，花粉萌發(fā)率最高，而當Ca2+濃度高于0.005%時，花粉萌發(fā)則明顯受到抑制，這與周瑞金等的研究結果[25]一致。

通過正交試驗，得到大白杜鵑花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基配方是10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002% CaCl2，在此條件下花粉萌發(fā)率最高，且遠超過單因素試驗中的最高萌發(fā)率。另外，當鈣離子為高水平而硼酸為低水平，或鈣離子為低水平而硼酸為高水平時，兩者表現(xiàn)出負交互作用。原因可能是單因素之間的交互作用促進了花粉萌發(fā)，如硼酸可以與蔗糖形成絡合物，從而促進果膠物質的合成、糖的吸收，進而更大程度地促進花粉萌發(fā)[15]。此外，硼還可能通過影響關鍵酶活性與Ca2+濃度梯度相關聯(lián)，影響其花粉管細胞壁的構建與生長[26]。試驗結果顯示，蔗糖對花粉萌發(fā)影響最大，硼酸次之，Ca2+對花粉萌發(fā)有促進作用，但影響比硼酸小。鈣離子對花粉萌發(fā)的影響較硼酸小的結論得到了其他研究者的支持，一般認為花粉細胞內鈣離子較多而硼素較少，因而萌發(fā)時胞外硼素的影響較胞外鈣離子的影響高[27]。

通過花期噴施具有促進花粉萌發(fā)和花粉管生長的物質的方法來提高結實率和促進種子發(fā)育、膨大是生產上的一項重要措施。本研究結果表明，大白杜鵑花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基組合10%蔗糖+0005%硼酸+0.002%CaCl2可為大白杜鵑雜交育種提供技術上的參考。在花期噴灑蔗糖、硼酸、CaCl2或者其三者組合有助于大白杜鵑結實，而在授粉過程中噴灑含有蔗糖、硼酸、CaCl2的花粉營養(yǎng)液的方法是輔助授粉的較好手段。但在實際生產中，由于營養(yǎng)液對花粉萌發(fā)的作用可能還與樹齡和溫度等其他因素有關，因此營養(yǎng)液的適宜濃度應根據(jù)環(huán)境條件經試驗而定。

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