顏?zhàn)雍瑐?，李明月，王一，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染豬可導(dǎo)致豬患豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE），是養(yǎng)豬業(yè)中常見的豬腹瀉疾病，病豬是該病的主要傳染源并向環(huán)境中擴(kuò)散和傳播病毒，如果該病毒侵入仔豬腸道內(nèi)便會造成仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉癥狀，傳播方式是糞-口[1]?；疾〉淖胸i死亡率極高。

TGEV 是單股正鏈RNA 病毒，包含4 種結(jié)構(gòu)蛋白依次為：纖突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。S 蛋白是糖基化蛋白位于病毒表面，在病毒的侵入過程中發(fā)揮作用[2]。N 蛋白具有高度保守的特點(diǎn)，常作為檢測TGEV 的靶蛋白[3]。M 蛋白在病毒粒子裝配的過程中發(fā)揮作用。像其他冠狀病毒一樣，共價連接的Poly（A）尾部結(jié)構(gòu)存在于TGEV 基因組的3′端，而帽子結(jié)構(gòu)連接在5′端[4]。TGEV 感染豬主要通過豬的口鼻及黏膜，當(dāng)外界環(huán)境中存在病毒粒子時，病毒從鼻腔進(jìn)入豬的呼吸系統(tǒng)，在呼吸道的黏膜中繁殖，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入豬的消化系統(tǒng)，其中小腸黏膜上皮細(xì)胞是病毒主要入侵的部位，宿主細(xì)胞的受體被TGEV S 蛋白識別后病毒吸附于小腸黏膜上皮細(xì)胞表面，隨后通過內(nèi)吞的方式進(jìn)入到豬小腸粘膜上皮細(xì)胞中[5]。致使其無法發(fā)揮其正常生理功能，降低其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。豬傳染性胃腸炎病毒在豬體內(nèi)的潛伏期與其生長情況存在密切聯(lián)系。一般狀況下仔豬的日齡較小相應(yīng)潛伏期就短；相反仔豬日齡越大那么其潛伏期長。新生仔豬從感染到發(fā)病通常需要15～20 h，而大型豬則需要2～3 d。這種疾病傳播很快，短時間內(nèi)就可在整個豬群中大面積傳播且難以控制。新生仔豬臨床癥狀最明顯，通常情況下疾病發(fā)生時仔豬突然嘔吐出未消化的乳凝塊，尤其在仔豬吃完母乳后半個小時嘔吐的頻率更高，進(jìn)而出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，起初糞便較少，隨后大量排泄水樣糞便。腹瀉會導(dǎo)致身體脫水，受影響的豬失去食欲，甚至食欲廢絕，缺乏能量。而后導(dǎo)致體重減輕和皮毛粗糙。在疾病后期，患病的仔豬因嚴(yán)重脫水和營養(yǎng)不良而體重減輕，體重迅速下降，體溫下降而瑟瑟發(fā)抖，哺乳仔豬從發(fā)病到死亡通常2～5 d[3，6]。少數(shù)耐受過后的仔小豬發(fā)育遲緩。保育期的豬群主要表現(xiàn)為水樣腹瀉，體重減輕，由于嚴(yán)重營養(yǎng)不良，飼料轉(zhuǎn)化率低變?yōu)榻┴i。肥育階段的豬對該病的抵抗能力更強(qiáng)，臨床癥狀為腹瀉、食欲不振、發(fā)冷。病情較輕的豬通常都會擠在一起來維持體溫，病得嚴(yán)重的豬會全身和肌肉顫抖，嚴(yán)重腹瀉，糞便中含有少量未消化固體。與哺乳仔豬比較，育肥豬極少出現(xiàn)嘔吐，從發(fā)病到轉(zhuǎn)歸大概在1 周左右，育肥階段的豬死亡率較低，但轉(zhuǎn)歸后體重減輕[7]。將病死的豬剖檢，除嚴(yán)重脫水外，與健康豬相比無明顯的區(qū)別，小腸是主要的病變組織。小腸腫脹，腸壁透明，腸腔內(nèi)常常充滿大量灰白色或黃綠色內(nèi)容物?？漳c和回腸的絨毛存在不同程度的萎縮或脫落現(xiàn)象，豬腸道絨毛長度和隱窩深淺二者之間的比（VH∶CD）將減小，腸系膜充血和腸系膜淋巴結(jié)腫大，表明豬的消化系統(tǒng)遭到了破壞。組織病理學(xué)的主要特征是小腸絨毛明顯萎縮，小腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生病理變化，如：固有結(jié)構(gòu)的喪失，并伴隨著空泡變性，壞死的上皮細(xì)胞有炎性細(xì)胞浸潤[1]。

TGEV 于1946 年美國首次報道，隨后在一些歐洲國家相繼報道，20 世紀(jì)60 年代傳入我國后對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[1，8]。也有報道TGEV 常與其他腸道病毒混合感染，這可能增加對仔豬的危害[9-10]。目前TGEV 病原學(xué)診斷的技術(shù)包括：膠體金技術(shù)、抗原ELISA 檢測和病毒核酸RT-PCR 檢測等。TGEV膠體金試劑盒、ELISA 試劑盒可以捕獲糞便中的TGEV 抗原，已經(jīng)在臨床中廣泛應(yīng)用[3]。研究人員利用特異性引物對TGEV 基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，然后在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察擴(kuò)增片段。已經(jīng)有數(shù)個TGEV 的傳統(tǒng)RT-PCR 檢測方法，這些方法現(xiàn)在大多被更為敏感的實(shí)時RT-PCR 方法取代[11]。以上方法都能夠?qū)GEV 臨床提供快速、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。TGEV 的分離較為困難，選擇病毒敏感的分離細(xì)胞尤為重要。前人的研究表明，豬甲狀腺細(xì)胞、豬腎細(xì)胞（PK-15）以及豬睪丸細(xì)胞（ST）等均可用于TGEV 分離，但是各個細(xì)胞系培養(yǎng)TGEV 時適應(yīng)情況不同。TGEV 在體外感染細(xì)胞后，可導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核聚集、胞漿有空泡生成，最后細(xì)胞脫落，在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)拉絲狀。TGEV 不耐熱，將病毒置于60 ℃的環(huán)境中10 min 可使病毒失活。但病毒可在低溫條件下長久保存。在光照或有機(jī)溶劑等不利因素下，病毒失活較快。因此在分離TGEV 時選用的豬腹瀉糞便及腸段應(yīng)保存于低溫環(huán)境并避免紫外照射[12]。TGEV 野毒在分離過程中病毒丟失的現(xiàn)象時有發(fā)生，也會出現(xiàn)CPE 不明顯的現(xiàn)象，一些毒株在分離之初病變輕微，不易察覺。這為病毒的分離培養(yǎng)帶來難度。目前實(shí)驗(yàn)室常用于TGEV 分離的細(xì)胞是PK-15 細(xì)胞和ST 細(xì)胞，研究人員通過對ST 細(xì)胞和PK15 細(xì)胞進(jìn)行TGEV 分離培養(yǎng)，結(jié)果表明隨著傳代次數(shù)的增多ST 細(xì)胞病毒滴度上升較快且適應(yīng)性更強(qiáng)[13]。我國學(xué)者通過這些細(xì)胞系相繼分離了一些TGEV，如JS2012，H16，SC-Y 等[14-15]。這些分離株的出現(xiàn)為了解TGEV 的流行病學(xué)與該病的防控奠定了一定基礎(chǔ)。

研究旨在分離并鑒定黑龍江省TGEV。將黑龍江省齊齊哈爾市某豬場豬腹瀉樣品鑒定為TGEV 陽性后接種PK-15 細(xì)胞并對其培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，通過細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）、RT-PCR、間接免疫熒光（indirect immunofluorescence，IFA）以及電鏡觀察等方法對傳代細(xì)胞毒進(jìn)行鑒定，最后成功獲得了一株TGEV，命名為HQ2016。該毒株的成功分離鑒定對黑龍江省TGEV 流行病學(xué)調(diào)查提供前期基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步研究其致病性，疫苗研發(fā)及診斷產(chǎn)品研制提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

病料取自實(shí)驗(yàn)室保存的2016 年黑龍江省齊齊哈爾市某豬場TGEV 疑似糞便及腸段。用剪刀將上述病料剪成小塊放入研缽中，緩緩倒入液氮充分混勻?qū)⑵溲心コ杉?xì)小的粉末狀。稱量后再加入3 倍樣本體積的PBS 溶液，接著利用震蕩器持續(xù)震蕩15 min，4 ℃6 000 rpm 離心15 min，取上清液直接進(jìn)行病毒RNA 提取或保存于-80 ℃。

1.2 引物設(shè)計(jì)

引物參考GenBank 中登陸的TGEV JS2012 株（KT696544.1）針對N 基因設(shè)計(jì)巢式RT-PCR 引物，引物由哈爾濱擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 主要試劑及設(shè)備

表2 主要試劑Table 2 The detail information of reagents

表3 主要儀器Table 3 The detail information of machines

1.4 病毒RNA 提取與cDNA 合成

按照病毒RNA 提取試劑盒操作指導(dǎo)提取病毒RNA。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μL，隨機(jī)引物0.5 μL，Buffer 2 μL，RNA 酶抑制劑（40 U·μL-1）0.25 μL，dNTP（10 mol·L-1）1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）0.5 μL，隨后在反應(yīng)體系內(nèi)加入ddH2O 將體積升高到10 μL。將上述液體放置在42 ℃水浴鍋中持續(xù)30 min，最后將液體迅速取出并放入70 ℃水浴鍋中抑制其繼續(xù)反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄成功后的cDNA 直接用于巢式RT-PCR鑒定或保存于-80 ℃冰箱。

1.5 樣品巢式RT-PCR 檢測

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，上述步驟反復(fù)操作30 遍；接著在72 ℃環(huán)境下再延伸5 min。內(nèi)套擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度為56 ℃，其他條件不變。最后收集內(nèi)套PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，放置到濃度是1%的瓊脂糖凝膠里進(jìn)行電泳分析，最后通過凝膠成像設(shè)備查看，同時記錄最終的結(jié)果。

1.6 病毒的分離培養(yǎng)

將TGEV 陽性樣品研磨過濾后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）中10 倍稀釋。放置于4 ℃的離心機(jī)里面持續(xù)10 min，接著量取上清液通過0.22 μm 的濾膜過濾后接種于生長狀態(tài)良好，長滿單層的PK-15 細(xì)胞中，加入0.3%濃度胰酶的DMEM 放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱處理1.5 h，緩緩倒掉培養(yǎng)瓶中液體，加入適量10%胎牛血清培養(yǎng)液37 ℃培養(yǎng)，沒有接種上述樣品的PK-15 細(xì)胞為陰性對照。觀察細(xì)胞狀態(tài)直至出現(xiàn)細(xì)胞病變，對未出現(xiàn)病變的細(xì)胞經(jīng)3 次凍融循環(huán)后繼續(xù)接種，連續(xù)盲傳直至出現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞病變，當(dāng)觀察到80%細(xì)胞病變時，將上清液和細(xì)胞進(jìn)行3 次凍融循環(huán)。在1 500×g 離心15 min，收集上清液在-80 ℃下儲存。

1.7 RT-PCR 病原特異性鑒定

提取第15 代分離毒的病毒RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進(jìn)行TGEV 巢式RT-PCR 擴(kuò)增，并通過實(shí)驗(yàn)室已建立的方法對上述cDNA 進(jìn)行PEDV 與PDCoV 的RT-PCR 特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物于濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測，凝膠成像分析儀下觀察并保存結(jié)果[16-17]。

1.8 間接免疫熒光試驗(yàn)

分離毒接種PK-15 細(xì)胞48 h 后。經(jīng)多聚甲醛溶液處理30 min，用PBS 溶液清洗細(xì)胞3 次；接著在所有孔當(dāng)中滴注0.2%細(xì)胞穿孔溶液Triton X-100 250 μL持續(xù)10 min 之后將殘余液體倒掉，然后用PBS 溶液對細(xì)胞進(jìn)行3 次清洗；接著在所有孔當(dāng)中滴注250 μL 的0.3% BSA 來封閉非特異性抗原，然后在37 ℃密封環(huán)境下靜置30 min，隨后用PBS 溶液對細(xì)胞進(jìn)行3 次清洗；接著在所有孔當(dāng)中滴注1∶800 倍的TGEV N 蛋白單克隆抗體，隨后放置于室溫環(huán)境作用1 h，然后用PBS 溶液對細(xì)胞進(jìn)行3 次清洗；接著在所有錄入孔當(dāng)中滴注1∶200 倍稀釋的FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光抗體，進(jìn)行IFA 鑒定。

1.9 電鏡觀察

取第15 代分離毒，接種于PK-15 細(xì)胞48 h 出現(xiàn)CPE 后，在生物安全柜中收集培養(yǎng)液和PK-15 細(xì)胞于一個干凈的EP 管中，經(jīng)3 次凍融循環(huán)，通過離心以收取上層液體。接著將上層液體置于5 000 rpm的離心機(jī)上持續(xù)30 min，收集上清液，把前面收集的液體置于離心機(jī)中15 000 rpm 并且設(shè)置溫度為4 ℃，持續(xù)離心2 h。收取離心管中的沉淀通過酸堿度為7.0 的溶液來進(jìn)行懸浮，然后磷鎢酸負(fù)染電鏡進(jìn)行結(jié)果觀察。

1.10 病毒TCID50 計(jì)算

病毒液按照10 倍的比例進(jìn)行逐一稀釋，然后將獲得的液體接種在長滿PK-15 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板當(dāng)中，同步設(shè)置對照組。把上述培養(yǎng)板擺放到溫度為37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱里面靜置，觀察產(chǎn)生CPE 的孔數(shù)。根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算第15 代病毒的TCID50[18]。

2 結(jié)果

2.1 樣品巢式RT-PCR 鑒定結(jié)果

為了確定分離樣本是TGEV 陽性，我們將實(shí)驗(yàn)室保存的腹瀉樣品剪碎研磨處理后，經(jīng)過RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行巢式RT-PCR 鑒定，結(jié)果（圖1）表明，出現(xiàn)了與預(yù)期長度相符的目的片段，證明分離樣品準(zhǔn)確。

圖1 腹瀉樣品TGEV N 基因巢式RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The induced for TGEV partial N gene by nest RT-PCR

2.2 病毒分離CPE 觀察

將TGEV 陽性病料接種于PK-15 細(xì)胞。結(jié)果（圖2）顯示，盲傳15 代48 h 時PK-15 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE。而未接毒的細(xì)胞狀態(tài)良好。

2.3 RT-PCR 病原特異性鑒定結(jié)果

為了從核酸角度驗(yàn)證分離毒是TGEV，我們將第15 代分離毒通過巢式RT-PCR 鑒定，利用TGEV N 基因內(nèi)、外套特異性引物，擴(kuò)增N 基因片段。結(jié)果（圖3）顯示，出現(xiàn)的片段與預(yù)期大小相符。其他豬腹瀉病毒均為陰性。說明只有TGEV 在PK-15 細(xì)胞中得到了增殖。

圖2 PK-15 細(xì)胞感染TGEV（P10）后出現(xiàn)CPEFig.2 CPE on PK-15 cells infected with the TGEV（P10）

圖3 TGEV（P15）的巢式RT-PCR 鑒定Fig.3 Identification of the TGEV（P15）isolate by nested RT-PCR

2.4 IFA 鑒定結(jié)果

隨后我們通過IFA 試驗(yàn)鑒定分離毒是TGEV，選擇第15 代分離毒進(jìn)行驗(yàn)證。利用TGEV N 蛋白鼠源單克隆抗體作為一抗，正常培養(yǎng)的PK-15 細(xì)胞為陰性對照。結(jié)果（圖4）顯示，接毒組出現(xiàn)明顯熒光信號，而對照組未見熒光信號。

2.5 電鏡觀察結(jié)果

為進(jìn)一步觀察分離毒的形態(tài)特征，我們通過對TGEV 第15 分離毒代擴(kuò)大培養(yǎng)，超速離心，沉淀物經(jīng)負(fù)染后電鏡下觀察，如圖5 可以看見病毒粒子周圍有一圈類似花冠的典型冠狀病毒結(jié)構(gòu)，在視野中央病毒粒子呈不規(guī)則的橢圓形，直徑約100 nm。將研究分離毒命名為TGEV HQ2016。

圖4 TGEV（P15）感染PK-15 細(xì)胞的IFA 鑒定Fig.4 Identification of the isolate in PK-15 cells by IFA

2.6 病毒TCID50 計(jì)算結(jié)果

對盲傳15 代的分離毒進(jìn)行10 倍稀釋并接種在長滿單層PK-15 細(xì)胞的96 孔板中，如表4，第3 天CPE 的孔數(shù)趨于穩(wěn)定，根據(jù)Reed-Muench 法公式計(jì)算病毒TCID50為10-5.25/0.1 mL。

圖5 TGEV（P15）電鏡觀察結(jié)果Fig.5 Observation of TGEV（P15）by electron microscopy

表4 病毒滴度（TCID50）計(jì)算Table 4 Calculation of virus titer by TCID50

3 討論

由于冠狀病毒能夠引起哺乳動物及禽類發(fā)病，進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失。TGEV 與PEDV 均是α-冠狀病毒中的成員，這兩種疾病也是目前引發(fā)仔豬病毒性腹瀉的主要病原[19]。TGEV 僅一種血清型，前人研究表明，豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）與TGEV 有一定的聯(lián)系，但該病主要表現(xiàn)為豬的呼吸道癥狀[20]。近期，實(shí)驗(yàn)室通過2015～2018 年全國22 省及自治區(qū)的部分豬場豬群腹瀉樣本進(jìn)行TGEV 檢測，結(jié)果顯示，17 個省份及自治區(qū)存在TGEV 感染的情況。其中陜西、四川、湖北等地陽性率較高[21]。近些年，其他研究人員也在貴州、浙江、廣西等地檢測到不同程度的TGEV 感染[22-23]，這些調(diào)查結(jié)果提示目前該病在全國范圍內(nèi)分布廣泛，值得引起重視?，F(xiàn)階段該病尚未由有效的治療措施，疫苗免疫成為預(yù)防的主要方法。我國學(xué)者通過TGEV 弱毒株（華毒株），成功研制出豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-豬輪狀病毒三價活疫苗，臨床試驗(yàn)表明，腹瀉發(fā)病率從8%～12%降到了3%～5%[24]。此外我國還有TGEV XH08 制成的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗，該疫苗能夠?yàn)樽胸i提供有效的抗病能力[25]。這些疫苗的出現(xiàn)對我國TGEV 防控起到重要作用，但新疫苗的研發(fā)依然有必要。試驗(yàn)所用引物是針對TGEV 的N 基因，而N 基因所編碼的核衣殼蛋白主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，在病毒的感染宿主細(xì)胞時，當(dāng)病毒粒子處于組裝過程中N 蛋白起到重要作用，且具有增強(qiáng)病毒RNA 復(fù)制的能力。試驗(yàn)選擇黑龍江省某豬場豬腹瀉樣品，經(jīng)巢式RT-PCR 檢測顯示為TGEV 陽性之后，利用PK-15 細(xì)胞分離TGEV，分離之初CPE 不明顯。進(jìn)而繼續(xù)傳代培養(yǎng)，CPE 出現(xiàn)的時間提前且變得明顯。盲傳15 代時CPE 明顯，一般在接種后36～48 h 即可出現(xiàn)典型的CPE，此時細(xì)胞呈現(xiàn)圓縮聚集并形成合胞體，部分細(xì)胞脫落，與前人病毒分離的結(jié)果保持一致[13，15]。有研究表明，PEDV 與PDCoV 均可通過豬腎細(xì)胞在體外分離。因此，研究通過對第15 代分離毒進(jìn)行病毒特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明，PEDV 與PDCoV 均為陰性，不存在與其他豬腹瀉病毒混和的情況。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示PK-15接毒48 h 后出現(xiàn)了明顯熒光信號，對照組無熒光信號。最后我們將分離毒通過在電鏡觀察方法進(jìn)一步了解病毒結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，電鏡下病毒粒子表面出現(xiàn)形似花冠狀的典型冠狀病毒結(jié)構(gòu)。對成功分離的病毒命名TGEV HQ2016。測定第15 代分離毒TCID50為10-5.25/0.1 mL，與TGEV JS2012 P20TS（10-5.5/0.1 mL）毒價相近，高于TGEV AHHF P5TS（10-4.12/0.1 mL），推測該分離毒毒力強(qiáng)[26-27]。未來可通過動物致病性試驗(yàn)進(jìn)一步了解該毒株的致病力，對該毒株進(jìn)行遺傳演化分析可為該地區(qū)TGEV 流行情況提供參考，同時該毒株繼續(xù)傳代后TCID50的測定，是提示能否成為疫苗株的重要指標(biāo)。

4 結(jié)論

研究通過TGEV 陽性仔豬糞便利用PK-15 細(xì)胞成功分離并鑒定一株TGEV，命名為TGEV HQ2016。該毒株的成功分離鑒定對進(jìn)一步研究其致病性，疫苗研發(fā)及診斷產(chǎn)品研制提供前期基礎(chǔ)。