趙志強(qiáng)，肖萌，蘇瑩，林凱，徐向東

（1.烏魯木齊市第四人民醫(yī)院成癮醫(yī)學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830002； 2.新疆大學(xué)軟件學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2010 年的不完全統(tǒng)計(jì)，在世界大多數(shù)國(guó)家（53.9%）酒精是社會(huì)中最容易獲得和濫用的物質(zhì)，這一事實(shí)可能與酒精容易獲得和合法使用的特點(diǎn)有關(guān)。酒精依賴(lài)癥（AD）通常是由長(zhǎng)期大量飲酒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)主要為對(duì)酒精的過(guò)度渴求和需要飲酒的強(qiáng)迫性體驗(yàn)，并以身體對(duì)長(zhǎng)期飲酒的自我調(diào)節(jié)為特征。它的發(fā)生與生物學(xué)、心理和社會(huì)環(huán)境密切相關(guān)，其中生物學(xué)因素可能是其產(chǎn)生的基礎(chǔ)[1-4]。大量研究表明[5-6]，酒精依賴(lài)患者在運(yùn)動(dòng)功能和記憶、注意、執(zhí)行、社會(huì)認(rèn)知等方面存在缺陷，從而給個(gè)體和社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[7-8]。因此，作為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，我們必須進(jìn)一步研究該病的病因和發(fā)病機(jī)制，以便進(jìn)行有效的預(yù)防和控制。

大量研究證實(shí)[9-10]，酒精依賴(lài)具有明顯的遺傳易感性。這些數(shù)據(jù)是通過(guò)雙胞胎研究、寄養(yǎng)兒童研究以及神經(jīng)生化研究獲得的，這表明酒精依賴(lài)是一種復(fù)雜的多基因遺傳病。研究發(fā)現(xiàn)，40%～60%的酒精依賴(lài)是由遺傳因素造成的，男性的遺傳能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性[11]。研究還表明，酒精使用障礙的表型變異中有50%～60%與基因相關(guān)[12]。由此可見(jiàn)，遺傳因素對(duì)酒精依賴(lài)的發(fā)生有著非常重要的影響。

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，對(duì)酒精依賴(lài)的易感基因或致病基因的相關(guān)遺傳學(xué)研究迅速展開(kāi)。目前，人們認(rèn)為與酒精相互作用的主要神經(jīng)遞質(zhì)包括血清素、多巴胺（DA）[13]、γ -氨基丁酸（GABA）和內(nèi)源性阿片受體。這些參與酒精強(qiáng)化作用的各種神經(jīng)遞質(zhì)相互作用影響大腦，其中5-HT 在酒精的獎(jiǎng)勵(lì)、偏好、依賴(lài)和渴求中起主要作用。

5-HT 在人腦中廣泛分布，參與各種生理功能和病理狀態(tài)的調(diào)節(jié)，包括睡眠、飲食、情感和精神。研究發(fā)現(xiàn)，血清素受體5-HT3 與酒精渴求、中毒、上癮和其他酒精相關(guān)疾病有關(guān)。其中，我們發(fā)現(xiàn)酒精可以直接與5-HT3受體離子通道受體結(jié)合，在可引起中毒的濃度范圍內(nèi)增強(qiáng)離子電流[14]。Le 等人在對(duì)白色封閉群大鼠（Wistar）的研究中發(fā)現(xiàn)[15]，在大鼠進(jìn)行了12%的酒精自我訓(xùn)練28～31 天后，停藥9～10 天后，在5-HT 拮抗劑預(yù)給藥后，大鼠電擊后的酒精自我給藥明顯減少。因此，酒精和5-HT3 受體的作用部位可能是治療酒精依賴(lài)和其他物質(zhì)成癮的主要靶點(diǎn)。

SNP 在人類(lèi)基因組學(xué)中廣泛存在[16]，由于其信息量大、易于自動(dòng)檢測(cè)和分析，已成為第三代遺傳標(biāo)記。SNP 是導(dǎo)致個(gè)體之間在疾病易感性和藥物反應(yīng)方面存在顯著差異的主要原因之一。不同地區(qū)或種族的SNP在頻率和類(lèi)型上存在著實(shí)質(zhì)性的差異，這意味著在一個(gè)特定群體的正常個(gè)體基因組中，任何SNP 的特定核苷酸位置具有不同的堿基，并且其最低等位基因頻率不應(yīng)少于1%[17-18]。大量的基因關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)證實(shí)HTR3A 和HTR3B 與酒精依賴(lài)有關(guān)。Chamindi 和Bankole 等人研究發(fā)現(xiàn)rs10160548 和rs1176719 與物質(zhì)成癮及依賴(lài)有關(guān)，rs1176713 在歐美人群中與酒精依賴(lài)有關(guān)，HTR3A 基因上的rs176713、rs10160548、rs1176719 和HTR3B 基因上的rs4938056、rs3782025 對(duì)酒精依賴(lài)也存在影響[19-21]。

新疆地區(qū)人群長(zhǎng)期生活在中國(guó)的西北地區(qū)，他們生活在古絲綢之路上，在歐亞大陸的人類(lèi)遷徙和進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用[22]?；诂F(xiàn)有理論，本研究旨在確定新疆地區(qū)酒精依賴(lài)患者HTR3A 和HTR3B 的基因多態(tài)性，以進(jìn)一步探討5-HT 相關(guān)基因在酒精依賴(lài)中的作用?；蛟诰凭蕾?lài)中的作用，為進(jìn)一步的基因研究和酒精依賴(lài)的精確治療提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究人群

我們選取了2018 年1 月—12 月在新疆精神衛(wèi)生中心（烏魯木齊市第四人民醫(yī)院）成癮醫(yī)學(xué)科住院的199例患者。參與本次調(diào)查的患者均為男性，符合《國(guó)際疾病及相關(guān)健康問(wèn)題統(tǒng)計(jì)分類(lèi)（第10 版）》“酒精使用 障礙引起的心理和行為”診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有被試年齡在18 歲以上，文化程度在初中以上，能夠充分理解問(wèn)卷的相關(guān)內(nèi)容并能夠在沒(méi)有幫助的情況下完成評(píng)估。我們排除了患有器質(zhì)性精神障礙的患者和無(wú)法合作完成此評(píng)估的患者。正常對(duì)照組為18～60 歲的健康男性志愿者。他們同意參與研究，簽署書(shū)面知情同意書(shū)，并使用隨機(jī)抽取的審計(jì)量表評(píng)估（AUDIT）酒精濫用或依賴(lài)的嚴(yán)重程度（少于8 分除外）。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：患有嚴(yán)重的 心、肝、腎、內(nèi)分泌和其他身體疾病的患者；患有嚴(yán)重精神障礙和其他腦器質(zhì)性精神障礙的患者；具有導(dǎo)致退縮或無(wú)法完成調(diào)查的所有其他因素的患者。

調(diào)查和隨訪的結(jié)果基于患者參與的原則，獲得患者或患者監(jiān)護(hù)人的知情同意，并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)新疆精神衛(wèi)生中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 數(shù)據(jù)收集

本研究血樣及一般人口社會(huì)學(xué)調(diào)查均由新疆精神衛(wèi)生中心（烏魯木齊市第四人民醫(yī)院）成癮科醫(yī)務(wù)人員獨(dú)立完成。每個(gè)研究對(duì)象均提供3～5 ml 外周血樣本，并且均同意研究目的和實(shí)驗(yàn)程序。研究方案是根據(jù)赫爾辛基宣言進(jìn)行的，并得到了醫(yī)院人類(lèi)研究委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 SNP 選擇和基因分型

在查閱了之前的文獻(xiàn)報(bào)道和NCBI 搜索后，我們從研究中總共選取了20 個(gè)SNP 進(jìn)行遺傳分析。 它們位于HTR3A 和HTR3B 基因中，并且具有最小的等位基因頻率（MAF＞5%）。使用GoldMag?反粒子法（中國(guó)西安金磁有限公司），根據(jù)說(shuō)明書(shū)從血液中提取基因組DNA 樣本，使用Nano drop 2000C 測(cè)定DNA 濃度（Thermo Scientific, Waltham, USA, Massachusetts）。 使用Sequenom MassARRAY Assay Design 3.0 軟件（美國(guó)加州圣地亞哥）設(shè)計(jì)多SNP MassEXTEND 分析。使用Sequenom MassARRAY RS1000 對(duì)SNP 基因型進(jìn)行分型（美國(guó)加州圣地亞哥），使用Sequenom Typer 4.0 軟件（美國(guó)加州圣地亞哥）進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

我們使用Microsoft Excel（Redmond，華盛頓，美國(guó)）和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包（SPSS 在芝加哥，伊利諾伊州，美國(guó)）進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙相檢驗(yàn)，并且P ≤0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用對(duì)照之間的精確測(cè)試來(lái)評(píng)估每個(gè)tSNP 頻率是否偏離哈迪-溫伯格平衡（HWE）（P＞0.05），我們利用χ2檢驗(yàn)比較病例和對(duì)照組之間的基因型頻率和等位基因頻率。為了估計(jì)遺傳多態(tài)性和酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，我們使用了無(wú)條件邏輯回歸，并根據(jù)年齡和性別進(jìn)行了調(diào)整，估計(jì)了比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）。在對(duì)照中，調(diào)用最常見(jiàn)的基因型作為參考等位基因。我們使用多元邏輯回歸模型（共顯性、顯性、隱性、過(guò)顯性和加性）來(lái)評(píng)估某些SNP 與酒精依賴(lài)之間的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 一般人口統(tǒng)計(jì)特征和哈迪-溫伯格平衡

共有396 名受試者參與了調(diào)查和研究，均符合條件并參與到研究結(jié)束。病例組平均年齡為（42.51±10.36）歲，對(duì)照組平均年齡為（42.15±9.08）歲。在對(duì)所有位點(diǎn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡定律分析后，P 值均大于0.05（表1）。研究對(duì)象的基本特征均記錄。兩組之間在年齡分布或受教育程度方面無(wú)顯著差異，但是婚姻狀況存在顯著差異。

表1 關(guān)于SNP 的HWE 結(jié)果和基本信息

2.2 SNP 與酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系

野生型等位基因相對(duì)于每個(gè)SNP 的次要等位基因是危險(xiǎn)因素。使用χ2檢驗(yàn)，有三個(gè)SNP 被認(rèn)為與酒精依賴(lài)的發(fā)生率顯著相關(guān)。在基因型模型中，rs10160548與酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（P=0.014）；在顯性模型中，當(dāng)個(gè)體的rs2276305 攜帶“A”等位基因時(shí)，酒精依賴(lài)的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=2.09, 95%CI=1.02-1.31, P=0.042）。Rs1176722 可能是酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)增加的位點(diǎn)（等位基因模型：OR=1.58, 95%CI=1.04-2.40, P=0.032）（表2）。經(jīng)過(guò)Fisher 檢驗(yàn)，rs10160548 和rs1176722 與酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性仍然顯著（表3）。其他與酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著相關(guān)性的SNP 結(jié)果另表記錄。

表2 SNP 等位基因和基因型模型的卡方檢驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

表3 Fisher 檢驗(yàn)后SNP 等位基因和基因型模型的卡方檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 SNP 與酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)之間的邏輯模型分析

我們進(jìn)一步評(píng)估了20 個(gè)SNP 在5 個(gè)邏輯模型（等位基因、顯性、隱性、基因型和加性）中酒精依賴(lài)的風(fēng)險(xiǎn)（表4）?；蛐蜑镚T 的Rs10160548 增加了基因型模型中酒精依賴(lài)的可能性（OR=1.66, 95%CI=1.08-2.56, P=0.021）。對(duì)于A 等位基因，rs1176722 在等位基因模型中（OR（95%CI）=1.576（1.038-2.394）, P=0.033），在加性模型中（OR（95%CI）=1.63（1.055-2.517）, P=0.028）增加了酒精依賴(lài)的風(fēng)險(xiǎn)。Rs2276305 在基因型模型（GA 基因型：OR（95%CI）=2.186（1.035-4.619）, P=0.040）和顯性模型（AA/AG, OR（95%CI）=2.091（1.015-4.311）, P=0.046）中與酒精依賴(lài)有顯著相關(guān)性。經(jīng)過(guò)邏輯模型校正分析，這三個(gè)SNP 的相對(duì)疾病風(fēng)險(xiǎn)仍然存在（表5）。

表4 Logistic 回歸模型中與AD 相關(guān)的SNP 的Logistic 分析

表5 校正后Logistic 回歸模型中與AD 相關(guān)的SNP 的Logistic 分析

3 討論

我們探索了新疆地區(qū)人群中HTR3A 和HTR3B 基因的SNP 與酒精依賴(lài)風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。我們的研究支持了5-HT 在酒精依賴(lài)的發(fā)病機(jī)制中起重要作用的觀點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)HTR3A（rs1176722 和rs10160548）和HTR3B（rs2276305）與新疆地區(qū)患者的酒精依賴(lài)顯著相關(guān)，這表明HTR3A 和HTR3B 可能參與了這些個(gè)體的遺傳易感性。

Rs1176722（IVS1-19G＞A）位于HTR3A 基因序列的內(nèi)含子區(qū)域[22]。我們的研究顯示，病例組與對(duì)照組之間存在顯著差異，HTR3A 是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)5-HT3 受體亞基。它最早由Maricq 等人于1991 年從倉(cāng)鼠胚胎腦細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞瘤小鼠的雜交細(xì)胞系NCB-20 中克隆出來(lái)[23]。HTR3A 基因跨度約為15 kb，包含9 個(gè)外顯子，大小在45～845 bp 之間，通過(guò)編碼標(biāo)準(zhǔn)的5-HT3A亞基，我們觀察到該亞基由478 個(gè)氨基酸組成[24]。另有研究報(bào)道HTR3A 基因序列位于染色體11q23 上[25]。在本研究中，該部位顯著增加了酒精依賴(lài)的風(fēng)險(xiǎn)。為了進(jìn)一步研究其功能，有必要在大樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)。由于rs1176722 不參與內(nèi)含子區(qū)域蛋白的直接表達(dá)，因此有必要對(duì)其可能的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)Rs10160548 的G 等位基因與新疆地區(qū)個(gè)體對(duì)酒精依賴(lài)的易感性有關(guān)，該位點(diǎn)位于HTR3A 基因的第6 個(gè)內(nèi)含子與外顯子連接的位置，可以通過(guò)改變基因的剪接位置來(lái)研究其對(duì)疾病的影響。在以前涉及該方面的研究 中[26]，通過(guò)相同的機(jī)制導(dǎo)致非洲裔美國(guó)人對(duì)煙草的依賴(lài)程度增加，該結(jié)果得到了本研究的支持。

我們研究的第三個(gè)主要發(fā)現(xiàn)是HTR3B 基因5 外顯子的低頻同義變體rs2276305 與酒精依賴(lài)顯著相關(guān)。在全球范圍內(nèi)，很少有關(guān)于rs2276305 與酒精依賴(lài)之間關(guān)系的分析。在一些關(guān)于尼古丁和酒精依賴(lài)的研究中，HTR3B 基因rs2276305（A/G）多態(tài)性與成癮、依賴(lài)的嚴(yán)重程度和某些癥狀有關(guān)[27]。

我們首次發(fā)現(xiàn)HTR3A 和HTR3B 與新疆地區(qū)人群酒精依賴(lài)的發(fā)生密切相關(guān)，它們位于染色體11q23 上。關(guān)于HTR3A、HTR3B 與酒精依賴(lài)之間關(guān)系的研究并不多，在一些研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酒精通過(guò)增加組蛋白脫羧酶活性而增加5-HT3 受體的基因表達(dá)。其他研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飲酒會(huì)影響HTR3A 等基因的甲基化水平。一些研究還發(fā)現(xiàn)[28-29]，在酒精依賴(lài)患者中，HTR3A 和HTR3B基因突變與酒精使用障礙和反社會(huì)人格障礙有關(guān)。結(jié)合我們對(duì)酒精依賴(lài)的發(fā)病機(jī)理的研究，我們推斷HTR3A和HTR3B 在酒精依賴(lài)的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論

我們對(duì)新疆地區(qū)人群中HTR3A 和HTR3B 基因SNP 與酒精依賴(lài)關(guān)系的初步研究表明，rs10160548、rs1176722 和rs2276305 與酒精依賴(lài)的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。雖然本研究取得了一些預(yù)期的結(jié)果，但仍存在一些局限性。首先，作為基因SNP 的病例對(duì)照關(guān)聯(lián)分析，本研究的樣本量相對(duì)較小。其次，酒精依賴(lài)者和健康對(duì)照者在年齡和受教育程度方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是婚姻狀況的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后，我們選擇了20 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。雖然它們經(jīng)過(guò)篩選并結(jié)合先前文獻(xiàn)報(bào)道被選擇為SNP 位點(diǎn)，但不足以反映全部基因信息。

本次研究樣本量較小，所入組的患者也均為男性，故存在樣本量偏移的問(wèn)題，加之觀察時(shí)間尚短，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、多中心、長(zhǎng)病程的完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

利益競(jìng)爭(zhēng)聲明

作者聲明，他們沒(méi)有已知的可能影響這篇論文所報(bào)道的工作的相互競(jìng)爭(zhēng)的經(jīng)濟(jì)利益或個(gè)人關(guān)系。

致謝

本研究工作得到了新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市科技計(jì)劃（Y16130026）支持