張亞光，范明松，高 崎**

（1.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201703；2.上海雷允上藥業(yè)有限公司，上海 200336）

猴頭菌[Hericium erinaceus（Bull.ex Fr.）Pers.]，俗稱猴頭、猴頭菇、陰陽(yáng)菇、猴菜、刺猬菌等，為擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agariomycetes）紅菇目 （Russulaemetica） 猴頭菌科 （Hericiaceae）的大型食用菌，屬腐木類真菌[1]，廣泛分布于我國(guó)河北、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、廣西、四川、云南、湖南等地[2]。栽培歷史悠久，種質(zhì)資源多樣，年產(chǎn)經(jīng)濟(jì)價(jià)值達(dá)30億元人民幣[3]。猴頭菌食藥兼用，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；子實(shí)體內(nèi)含抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌的物質(zhì)，長(zhǎng)期食用可助消化、利脾胃[4]。猴頭菌味甘性平，對(duì)各類常見(jiàn)的慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病有一定抑制作用，研究表明發(fā)揮該作用的主要活性成分為多糖，可能通過(guò)調(diào)節(jié)SOD酶的變化，降低氧化損傷，發(fā)揮抑制胃炎和潰瘍性結(jié)腸炎的作用，通過(guò)影響胃癌細(xì)胞凋亡、遷移和增殖抑制胃癌[5-6]。此外有研究者發(fā)現(xiàn)猴頭菌提取物對(duì)引起胃病的幽門螺旋桿菌有一定抑制作用[7]。目前國(guó)內(nèi)臨床常用猴頭菌復(fù)方制劑或聯(lián)合療法，治療慢性胃炎、消化道潰瘍、復(fù)發(fā)性口瘡等[8-9]。當(dāng)前以猴頭菌菌絲體為原料，已開(kāi)發(fā)出猴頭菌片、猴頭菇口服液等產(chǎn)品，未來(lái)在臨床上應(yīng)用前景廣闊。

猴頭菌分子生物學(xué)研究起步相比我國(guó)其他常見(jiàn)大型食用菌較晚。近年來(lái)，由于其保健功效和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，相關(guān)研究已經(jīng)從亞洲局部地區(qū)擴(kuò)展到全世界范圍。研究者通過(guò)分子生物學(xué)手段全面開(kāi)展了猴頭菌基因組、轉(zhuǎn)錄組、次生代謝物等方面研究，其分子生物學(xué)研究也取得了較快速進(jìn)展[4，10]。分子生物學(xué)技術(shù)全面引入為揭示猴頭菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系、基源鑒定、種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)、代謝調(diào)控機(jī)制以及育種和菌種保護(hù)等研究提供了分子基礎(chǔ)?，F(xiàn)已開(kāi)展了一定數(shù)量的探索不同種類以及不同時(shí)期猴頭菌中功能化合物分離鑒定的研究，其中一些功能化合物和相關(guān)聯(lián)基因深度開(kāi)發(fā)極具前景[11]。作者將從猴頭菌分子標(biāo)記、種質(zhì)資源的遺傳多樣性和功能基因等方面研究成果開(kāi)展綜述，以期為該領(lǐng)域的深入研究提供參考。

1 猴頭菌遺傳物質(zhì)

1.1 基因組學(xué)研究

基因組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，為藥用真菌快速鑒定提供了新途徑，其中大多數(shù)以DNA同源性為分析基礎(chǔ)。通過(guò)將相同表現(xiàn)型的菌株在基因水平上開(kāi)展鑒定，將猴頭菌的鑒定技術(shù)引入分子時(shí)代。猴頭菌的全基因組數(shù)據(jù)量與其他常見(jiàn)的大型食用菌的基因組數(shù)據(jù)量相比較大[12，14]，檢測(cè)工作開(kāi)展相對(duì)困難。通過(guò)分析其全基因組數(shù)據(jù)以及差異，全面呈現(xiàn)出猴頭菌的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。張琪等[13]優(yōu)化了猴頭菌原生質(zhì)體的制備條件，結(jié)合熒光染色以及分子鑒定獲得了高純度的單核體，為進(jìn)一步開(kāi)展猴頭菌基因組水平的研究提供了材料和基礎(chǔ)。陳娟等[14]首次報(bào)道了猴頭菇的基因組序列，通過(guò)采用MPS技術(shù)獲得了大小為39.35 Mb的基因組序列，編碼蛋白的基因平均序列長(zhǎng)度為1 345 bp。龔文斌等[12]完成了猴頭菌單核體更加精確的全長(zhǎng)測(cè)序和基因組組裝，生成的基因組大小為41.2 Mb，累積編碼了10 620個(gè)蛋白編碼基因。這些研究為猴頭菌系統(tǒng)進(jìn)化分析和基因組水平的重建提供了重要數(shù)據(jù)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

近年來(lái)，對(duì)猴頭菌作為功能食品的需求日益增長(zhǎng)引起了研究者的高度關(guān)注，針對(duì)不同的研究目的，目前已經(jīng)有一定數(shù)量的猴頭菌相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的報(bào)道。除了用于分子標(biāo)記挖掘，該技術(shù)還可用于轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)、功能基因的克隆和機(jī)理研究。陳娟等[14-15]最先研究了猴頭菌單核細(xì)胞菌絲、雙核的菌絲體和子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的差異，并比較了3個(gè)時(shí)期的高表達(dá)的基因，驗(yàn)證了猴頭菌不同時(shí)期下活性化合物的生物合成與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。朱伶俐等[16]通過(guò)對(duì)4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段猴頭菌子實(shí)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，分析得出不同時(shí)期差異基因。龔文斌等[14]在猴頭菌中發(fā)現(xiàn)了多種碳水化合物活性酶，共鑒定出447個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共同參與木質(zhì)纖維素降解的相關(guān)過(guò)程，與碳代謝過(guò)程相關(guān)聯(lián)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛運(yùn)用，植物基因克隆、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)越來(lái)越多的應(yīng)用到真菌的次生代謝物研究中[17]。目前猴頭菌屬真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)比較深入，已發(fā)現(xiàn)了83種不同類型的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包含脂肪酸、生物堿類化合物、萜類化合物、酚類化合物等，這些成分顯示了抗腫瘤、保肝護(hù)胃、降血糖、保護(hù)神經(jīng)、抗癌、抗衰老、抗氧化等多種生物學(xué)功能[18]。張靜等[19-20]詳細(xì)介紹了猴頭菇活性成分及其功能性的研究進(jìn)展，但就目前而言，有關(guān)猴頭菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方面內(nèi)容缺乏，且不夠系統(tǒng)。劉高強(qiáng)等[21]通過(guò)14C標(biāo)記示蹤技術(shù)，分析測(cè)定了葡萄糖的代謝流動(dòng)，已經(jīng)構(gòu)建出靈芝內(nèi)多糖的合成基本途徑，雖然還不完善，但是為研究猴頭菌多糖合成相關(guān)關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶提供了借鑒。張楠等[22]通過(guò)新一代RNA測(cè)序技術(shù)獲得了6株猴頭菌的轉(zhuǎn)錄組，并研究了轉(zhuǎn)錄組的特征和生物活性化合物特別是多糖的生物合成，有助于研究猴頭菌中多糖的生物合成過(guò)程，為探索猴頭菌以及擔(dān)子菌門（Basidiomycota）其他成員的次生代謝物的相關(guān)基因提供有用的信息。猴頭菌多糖的生物合成途徑相對(duì)復(fù)雜，相關(guān)研究將成為未來(lái)猴頭菌多糖研究的最具潛力的方向。此外，陳娟等[14]檢測(cè)到在萜類骨架、二萜類、倍半萜類和多酮類生物合成過(guò)程中，有多種酶和大量的細(xì)胞色素P450蛋白參與，并通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄分析揭示了猴頭菇中不同萜烯類和多酮類次生代謝物相關(guān)基因的調(diào)控差異。

1.3 功能基因定位

研究猴頭菌的功能基因是展示猴頭菌菌絲生長(zhǎng)和代謝調(diào)控機(jī)制的重要途徑，也是優(yōu)良新種育種和基因功能分析的相關(guān)方法。其中，猴頭菌的大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀如菌絲生長(zhǎng)速度、酶活性以及產(chǎn)量等都是數(shù)量性狀，是由多個(gè)數(shù)量基因座位和外在環(huán)境因素共同控制的[23-24]。食用菌誘變育種均是以獲得優(yōu)良農(nóng)藝性狀為目標(biāo)，常規(guī)方法難以實(shí)現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳變異[25]。通過(guò)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，尋找與數(shù)量性狀位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記是數(shù)量基因座位的研究方法[26]。朱伶俐等[27]通過(guò)研究猴頭菌子實(shí)體4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期后，篩選出最顯著的20條參與碳代謝、淀粉代謝和蔗糖代謝通路的相關(guān)基因，分析得到不同時(shí)期下的差異基因，初步定位多糖合成功能基因。

2 猴頭菌屬分子鑒定

2.1 基于常規(guī)PCR的分子標(biāo)記技術(shù)

采用PCR方法的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)是藥材基源鑒定的快速檢測(cè)方法，其通過(guò)擴(kuò)增條帶差異進(jìn)行分子鑒定，具有分辨率高且無(wú)需測(cè)序出DNA序列信息等優(yōu)點(diǎn)。目前應(yīng)用于猴頭菌鑒定的分子標(biāo)記主要有PFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、SRAP技術(shù)、IRAP技術(shù)和ISSR技術(shù)等。

PFLP技術(shù)是一種通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出一段特定的目標(biāo)靶向片段后，繼而采用限制性內(nèi)切酶統(tǒng)一處理的分子標(biāo)記技術(shù)[28-29]，可以較為簡(jiǎn)便、迅速的區(qū)分出不同的物種，屬于第一代分子標(biāo)記[30-31]。曹鴻雁等[32]利用ITS序列及ITS-RFLP分析，分別對(duì)福建省食用菌種質(zhì)資源庫(kù)保藏的猴頭菇及灰樹(shù)花、滑菇、黃傘、桑黃、姬松茸、蟲草、黑木耳和毛木耳8個(gè)近品進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定分類，初步形成了各相關(guān)物種的鑒別方法。

RAPD是使用一段較短的隨機(jī)寡核苷酸序列引物擴(kuò)增基因組的檢測(cè)技術(shù)，與RFLP技術(shù)類似，是第二代分子標(biāo)記，可用于快速鑒定真核生物[33-34]。宋慧[35]采用該技術(shù)檢測(cè)各菌株基因組DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性。Liu等[36]以猴頭菌液體和固體培養(yǎng)物為原料，證明采用RAPD和PCR技術(shù)結(jié)合的方式可以很好地篩選和鑒定猴頭菌的菌株。

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)，具有重復(fù)性好、簡(jiǎn)單操作、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)主要是對(duì)基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，定向分析基因的功能序列[37]。SRAP以其獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)在基因組學(xué)上廣泛應(yīng)用于分子遺傳圖譜的構(gòu)建以及基因定位等方面[38-39]。劉麒等[40]建立了猴頭菌菌絲體基因組DNA的高效提取方法和SRAP標(biāo)記體系，并利用SRAP標(biāo)記對(duì)17個(gè)猴頭菌菌株進(jìn)行了親緣關(guān)系分析和菌株鑒定，為菌株資源的鑒定、利用提供一定的研究基礎(chǔ)。

IRAP作為新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)，具有便捷、穩(wěn)定擴(kuò)增目標(biāo)條帶的特點(diǎn)[36-37]。王俊等[10]分析了30余種栽培猴頭菌菌株種間遺傳差異，為猴頭菌道地性研究、種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系研究和引種栽培提供了分子生物學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，34個(gè)猴頭菌菌株間均有遺傳上的差異，但遺傳相關(guān)性極高，同時(shí)表明我國(guó)猴頭菌栽培菌株間的遺傳背景較單一。

ISSR是在SSR技術(shù)原理上建立起來(lái)的一種分子標(biāo)記技術(shù)，可以很好地反應(yīng)出檢測(cè)物種的遺傳多樣性[38-39]。可用于快速實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基源或不同基因類型猴頭菌的準(zhǔn)確鑒定。楊爽[40]分析了65株猴頭菌的遺傳多樣性，結(jié)果顯示各個(gè)菌株在圖譜上都存在較強(qiáng)的特異性，所選用8個(gè)ISSR引物能將所有供試菌株相互區(qū)分開(kāi)，并表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

2.2 DNA條形碼鑒定

隨著DNA條形碼體系的建立，常見(jiàn)真核生物的鑒定逐漸邁入基因鑒定時(shí)代。DNA條形碼鑒定技術(shù)是一種采用一段序列長(zhǎng)度適宜、公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列用于物種間鑒別的方法。DNA條形碼的特征常包含具有適當(dāng)數(shù)目的特異性單核苷酸變異信息位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同物種達(dá)到足夠的區(qū)分度[41-42]。通過(guò)運(yùn)用這種簡(jiǎn)單、易推廣的方法來(lái)鑒定物種以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)信息化最終達(dá)到資源共享，高效、準(zhǔn)確鑒別物種的目的[43]。Chen等[44]提出ITS和ITS2均可作為植物和真菌的核心條形碼。王盼盼等[45]通過(guò)DNA條形碼技術(shù)，對(duì)所采集的包含猴頭菇在內(nèi)的74種常見(jiàn)大型真菌進(jìn)行了種屬水平的物種多樣性鑒定，將其鑒定為36屬、18科、6目、3綱，豐富了我國(guó)真菌的條形碼基因庫(kù)?；矢τ拦诘萚46]應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步構(gòu)建猴頭菇品種專屬的DNA條形碼，研究結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確進(jìn)行猴頭菌種間鑒定。基于條形碼構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的方法有多種，王俊等[10]分析表明，我國(guó)自然條件下采集得到的猴頭菌分3個(gè)種，即猴頭菌 （Hericium erinaceus）、珊瑚狀猴頭菌（Hericium coralloides） 和冷杉猴頭菌（Hericium abietis），其中猴頭菌與冷杉猴頭菌相互親緣關(guān)系較近，可有效區(qū)分猴頭菌菌種。

當(dāng)前幾種運(yùn)用于猴頭菌的分子鑒定方法各有優(yōu)點(diǎn)和局限。各方法間的相互比較詳見(jiàn)表1。

表1 幾種分子鑒定方法的比較Tab.1 Comparison of several identification methods

3 展望

猴頭菌食藥兼用，是高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的美味食用菌[52]。針對(duì)猴頭菌部分次生代謝物的生物活性及其種質(zhì)資源多樣性已經(jīng)進(jìn)行了大量研究工作，如生物堿和多糖類具有多種生理活性，保健、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等。但研究的系統(tǒng)性仍然不足，特別是目前猴頭菇藥用成分與對(duì)應(yīng)的調(diào)控基因之間的關(guān)聯(lián)還不清楚，對(duì)猴頭菌生長(zhǎng)發(fā)育和藥用成分的決定性作用部位和研究機(jī)理尚不清楚，子實(shí)體和菌絲體品質(zhì)控制難等問(wèn)題，這極大地限制了猴頭菌的深度開(kāi)發(fā)和利用[53-54]。分子生物學(xué)技術(shù)和功能基因的測(cè)序、復(fù)制以及定位技術(shù)的研究將對(duì)其有關(guān)品種的準(zhǔn)確識(shí)別、產(chǎn)品的深度開(kāi)發(fā)和相關(guān)種質(zhì)資源多樣性研究注入新的活力[55]。

未來(lái)在猴頭菌的分子生物學(xué)研究方面，可進(jìn)一步深入開(kāi)展測(cè)序工作，將基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和關(guān)鍵農(nóng)藝性狀指標(biāo)或藥學(xué)成分指標(biāo)檢測(cè)相結(jié)合，基于跨組學(xué)整合策略開(kāi)展猴頭菌活性成分累積機(jī)制研究及潛在調(diào)控元件篩選，挖掘出與關(guān)鍵農(nóng)藝性狀或藥學(xué)成分指標(biāo)相關(guān)的功能基因，為培育獲得高目標(biāo)活性成分含量的猴頭菌菌株奠定理論基礎(chǔ)；探究不同生長(zhǎng)階段猴頭菌的培養(yǎng)條件、藥用部位的異同，以及藥用成分的表達(dá)情況，測(cè)定代謝組以確定不同生長(zhǎng)階段猴頭菌代謝物的種類及含量差異；通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)，開(kāi)展猴頭菌遺傳多樣性研究，確立可靠的形態(tài)分類特征與適合的DNA條形碼片段，對(duì)現(xiàn)有品種進(jìn)行定型，為大型產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供技術(shù)保障、為猴頭菌真菌資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)；結(jié)合化學(xué)方法和物理手段，構(gòu)建誘變育種相關(guān)方法，進(jìn)行種質(zhì)改良[56]；最后是菌絲體以及子實(shí)體不同生長(zhǎng)時(shí)期猴頭菌多糖、多肽、生物堿、脂肪酸等藥用成分的表達(dá)和質(zhì)量標(biāo)志物成分的檢測(cè)以及對(duì)主要成分開(kāi)發(fā)應(yīng)用等方面開(kāi)展綜合研究。