張 曉 閆平平 張麗娟 陰 濤 高 強 鄭遵成

1.泰安市中心醫(yī)院康復科，山東 泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，山東 泰安 271000

神經病理性疼痛是臨床上常見且難治的一類慢性疼痛，因其具體發(fā)病機制不明，治療效果差，嚴重影響患者的生活質量。背根神經節(jié)持續(xù)受壓(chronic compression of the dorsal root ganglion, CCD)模型是一種常見的動物模型，可以很好地用于神經病理性疼痛發(fā)病機制的研究[1]。CCD 后大鼠能夠產生自發(fā)性疼痛、痛覺過敏等現(xiàn)象，能很好地模擬神經病理性疼痛常見癥狀[2]。瞬時感受器電位離子通道4(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)是一種非選擇性陽離子通道，具有機械敏感性，廣泛分布于動物腦、背根神經節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)、腎和肺等組織[3]。研究表明[4]，TRPV4參與CCD所致神經病理性疼痛的病理過程。P38MAPK信號轉導通路是細胞內重要的信號傳導系統(tǒng)，參與介導神經病理性疼痛病理過程，而P38MAPK分為P38α、P38β、P38γ和P38δ4個亞基，針對某個亞基在CCD所致神經病理性疼痛的研究較少。P38α是哺乳動物中主要的亞基之一，在背根神經節(jié)以及脊髓中廣泛存在[5]。研究表明[6]，予以P38αMAPK抑制劑SD-282可以顯著逆轉糖尿病神經病理性疼痛模型大鼠的機械異常性疼痛，提示P38αMAPK在慢性疼痛的調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過探討CCD后背根神經節(jié)細胞TRPV4和P38α基因表達的變化與大鼠機械刺激性疼痛的關系，初步明確TRPV4-P38α信號通路在CCD致神經病理性疼痛中的作用，以期為今后神經病理性疼痛的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年雄性Wister大鼠50只，體重為200～220 g，購自山東大學動物實驗中心。大鼠室溫、常濕飼養(yǎng)，普通飲食、自由飲水。隨機分為空白組10只、CCD手術組30只(術后1 d、7 d、21 d，各10只)、CCD+釕紅組10只。

1.2 實驗主要試劑及儀器

反轉錄試劑盒 ReverTra Ace? qPCR RT Kit(東洋紡，日本)、PCR 試劑盒 SYBR? Green Realtime PCR Master Mix(東洋紡，日本)，引物，Tgradient 96 反轉錄儀，lightcycler 2.0 型實時定量 PCR儀(Roche公司，瑞士)；釕紅(sigma，德國)；BME-404 型電子式機械測痛儀(中國醫(yī)學科學院生物工程研究所)。

1.3 CCD模型的制備

參考胡三覺等[2]制作CCD模型的方法：腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，腰背部剃毛，75%酒精消毒皮膚，鋪無菌洞巾。沿兩側髂棘連線正中向上做一約2 cm皮膚切口，分離右側椎旁肌肉，充分暴露右側 L4、L5 椎體橫突及椎間孔，將直徑0.63 mm“L”形棒的長端沿L4及L5椎間孔的前壁與脊柱斜向上成 30°角插入椎間孔內，短端置于椎間孔外。術后用生理鹽水沖洗切口，依次縫合肌肉、腰背筋膜和皮膚，腹腔注射青霉素 40 萬單位預防感染。排除術后出現(xiàn)肢體癱瘓的大鼠。

1.4 大鼠機械刺激縮爪反應閾值測量

空白組及CCD手術組于術前1 d、術后1 d、7 d和21 d進行機械刺激痛閾值測量，CCD+釕紅組于術后第7天鞘注TRPV4抑制劑釕紅10 μl(10 μmol/L)2 h前后均進行機械刺激痛閾值測量。方法如下：大鼠于紅色半透明玻璃箱內適應環(huán)境30 min后，使用BME-404型電子式機械測痛儀測量大鼠右后肢縮爪反應閾值。透過玻璃箱底部網(wǎng)格層以針刺端垂直刺激大鼠后肢足底第三、四趾間皮膚，大鼠出現(xiàn)縮爪或舔足現(xiàn)象視為陽性，記錄刺激數(shù)值(G)，每次刺激間隔 5 min，連續(xù)測 5 次，取其平均值作為統(tǒng)計變量。

1.5 動物組織取材

各組大鼠進行機械刺激縮爪反應閾值測量后將大鼠處死取材：腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，開胸，200 ml 預冷生理鹽水經左心室快速灌注，冰上快速取出L4及L5背根神經節(jié)，-80℃冰箱保存。

1.6 實時熒光定量PCR

取L4及L5背根神經節(jié)，1×PBS 清洗、修剪后，采用Trizol法提取組織總mRNA，紫外分光光度計測量RNA濃度，按照TOYOBO公司ReverTra Ace?qPCR RT Kit 說明書進行逆轉錄反應，將逆轉錄產物cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆?；? μg cDNA，按照TOYOBO公司SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 說明書進行操作，應用Roche公司lightcycler 2.0型實時定量PCR儀進行。

TRPV4引物序列為：

Forward: 5′-AAGTGGCGTAAGTTCGGG-3′

Reverse: 5′-TAAGGGTAGGGTGGCGTG-3′

P38α引物序列為：

Forward:5′-CGTTGCCGAGGCTCGTAG-3′

Reverse:5′-GCCTCTCCTGCGACATCTTC-3′

GAPDH引物序列為：

Forward: 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′

Reverse: 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′

擴增條件：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 6s，退火56 ℃ 10 s，共40個循環(huán)；延伸72 ℃ 15 s。擴增完畢進行溶解曲線分析，記錄各管中CT值。實驗結果采用2-ΔΔCT方法進行分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 大鼠背根神經節(jié)持續(xù)受壓后機械痛閾變化

與空白組相比，CCD1 d、7d、21 d組大鼠術側機械刺激痛閾值明顯下降；與CCD1 d組和CCD21 d組相比，CCD7 d組大鼠術側機械刺激痛閾值明顯下降；以上差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；見表1。

表1 大鼠背根神經節(jié)持續(xù)受壓后術側機械痛閾變化

與空白組相比：①P<0.001；與CCD1 d組和CCD21 d組相比：②P<0.001。

2.2 術后第7天鞘注TRPV4抑制劑釕紅2 h后機械痛閾變化

與給藥前相比，鞘注TRPV4抑制劑釕紅2 h后CCD大鼠術側機械刺激痛閾值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；見表2。

表2 鞘注TRPV4抑制劑釕紅2 h后術側機械痛閾變化

與CCD組相比：①P<0.001。

2.3 大鼠背根神經節(jié)持續(xù)受壓后背根神經節(jié)細胞TRPV4和P38α基因表達變化

與空白組相比，CCD組大鼠術側背根神經節(jié)細胞內TRPV4和P38α基因表達水平均明顯升高；與CCD1 d和21 d組相比，CCD7 d組大鼠術側背根神經節(jié)細胞內TRPV4和P38α基因表達水平明顯增加，以上差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測大鼠術側背根神經節(jié)TRPV4和P38α基因表達變化與空白組相比：①P<0.001；與CCD1 d組和CCD21 d組相比：②P<0.001。

2.4 鞘注TRPV4抑制劑釕紅2 h后大鼠背根神經節(jié)細胞P38α基因表達變化

與給藥前相比，鞘注釕紅2 h后，CCD組大鼠術側背根神經節(jié)細胞P38α基因表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測大鼠術側背根神經節(jié)P38α基因表達變化與空白組相比：①P<0.001；與CCD組相比：②P<0.001。

3 討 論

神經病理性疼痛是臨床常見的一種慢性疼痛，其發(fā)病機制復雜，臨床治療效果差，嚴重影響患者的生活質量，給家庭及社會帶來沉重負擔[7]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，細胞內多種信號通路介導了神經病理性疼痛的病理過程，而且多數(shù)的信號通路都匯集于P38MAPK。Piao等[8]發(fā)現(xiàn)，慢性壓迫性神經損傷可導致大鼠背根神經節(jié)細胞P38 MAPK表達增加，而鞘內注射p38 MAPK抑制劑SB203580，在下調其表達的同時可以顯著減少大鼠機械痛和溫痛覺的超敏現(xiàn)象。已知P38MAPK由P38α、P38β、P38γ和P38δ 4個亞基構成。P38α主要分布在背根神經節(jié)，P38β在腦組織小膠質細胞中含量較多，P38γ多見于骨骼肌，p38δ多見于腸、肺、腎和唾液腺的表皮細胞[5]。研究已證實，P38MAPK信號轉導通路參與介導了神經病理性疼痛病理過程，然而在介導慢性疼痛過程中何種亞基起主要作用尚不清楚。Morganti等[9]的研究表明，小膠質細胞內P38αMAPK缺失可以降低創(chuàng)傷引起的炎癥反應，從而減輕疼痛反應。另有研究發(fā)現(xiàn)[10]，予以P38αMAPK抑制劑UR13870可以明顯減低脊髓損傷大鼠的情感性疼痛行為。Galan-Arriero等[11]發(fā)現(xiàn)，神經病理性疼痛與小膠質細胞P38αMAPK信號通路的激活關系密切，其研究發(fā)現(xiàn)予以P38αMAPK抑制劑UR13870可顯著減少SNI模型動物對機械刺激和冷刺激的后肢反射亢進現(xiàn)象，并且對一般運動功能無影響，同時還能減輕SNI模型動物因疼痛所致的相關性焦慮行為。以上研究表明，P38αMAPK作為P38MAPK的亞基之一，在神經病理性疼痛的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

瞬時感受器電位離子通道(transient receptor potential channel, TRP)在高等動物組織器官內廣泛分布并參與視覺、聽覺、味覺、觸覺和痛覺等多種感覺信號的轉導過程[12]。TRPV4 屬 TRP 香草素受體亞家族成員，在背根神經節(jié)神經元胞膜、胞漿和胞核中均有表達，其作為多覺感受器，可被酸、機械牽張力、低滲透壓、花生四烯酸和4α-佛波酯等激活[13]。張楊等[4]研究發(fā)現(xiàn)，背根神經節(jié)持續(xù)受壓模型(CCD模型)大鼠術側后肢表現(xiàn)出明顯的機械痛和熱痛覺過敏，同時背根神經節(jié)細胞內檢測出TRPV4基因和蛋白表達明顯增加，予以TRPV4反義核苷酸干預可以部分逆轉CCD所致痛覺過敏現(xiàn)象，該研究提示，TRPV4在介導神經病理性疼痛中發(fā)揮一定作用。國外研究發(fā)現(xiàn)[14]，激肽受體通過敏化TRPV4離子通道誘導紫杉醇引起的嚙齒類動物周圍神經病痛覺敏化過程。在Dias FC等[15]的研究中，使用選擇性TRPV4通道拮抗劑HC-067047減輕了糖尿病神經病理性疼痛模型小鼠的機械性異常性疼痛，提示TRPV4可能參與了機械性痛的產生。以上研究采用不同的動物模型均表明TRPV4離子通道在神經病理性疼痛的發(fā)病過程中起重要作用。

背根神經節(jié)持續(xù)受壓模型(chronic compression of dorsal root ganglion，CCD)是目前常用的研究神經病理性疼痛發(fā)病機制的模型之一[1]。CCD大鼠表現(xiàn)出明顯的異常疼痛和痛覺過敏，可以模擬臨床上根性神經痛的典型癥狀[2,4]。目前，利用CCD模型對TRPV4-P38MAPK信號通路的研究多停留在蛋白水平，曲玉娟等[16]證實大鼠背根神經節(jié)細胞TRPV4和P38MAPK蛋白表達明顯影響大鼠的機械痛閾值，表明TRPV4-P38MAPK信號通路參與介導了CCD所致神經病理性疼痛過程。但從基因水平及P38MAPK具體亞基的參與方面的研究較少。本實驗通過構建CCD模型，對P38MAPK的亞基P38α及TRPV4的基因表達進行研究。實驗發(fā)現(xiàn)，CCD組大鼠較空白組均表現(xiàn)出術側機械痛閾值的明顯降低，這與其他學者的研究結果相類似，CCD組大鼠術側TRPV4和P38α基因表達均上調明顯，其中，CCD術后7 d組TRPV4和P38α基因的表達水平較CCD1 d和21 d組更明顯，二者的變化曲線與我們測得的CCD后大鼠術側機械刺激痛閾值的變化存在相關性。既往研究表明[16]，鞘注TRPV4抑制劑釕紅在顯著下調CCD大鼠術側TRPV4蛋白表達的同時，還可以降低其基因的表達水平。本實驗在CCD術后第7天對TRPV4進行干預，結果發(fā)現(xiàn)大鼠機械刺激痛被部分逆轉的同時，背根神經節(jié)細胞P38α基因的表達水平亦較前顯著降低，提示P38α與TRPV4在介導CCD所致神經病理性疼痛的過程中存在相關性。

綜上所述，TRPV4-P38α通路參與介導了CCD所致神經病理性疼痛病理過程。本研究從基因水平闡述了TRPV4-P38α通路在CCD所致神經病理性疼痛中的作用，對P38α蛋白水平及其具體上下游分子機制仍需做進一步探討。