竇曉寧，徐榮華，高玲，任雪蓮，張敏敏

濰坊市婦幼保健院，山東濰坊261011

遺傳性耳聾基因突變是造成兒童聽力障礙的主要原因，及時(shí)進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)可以明確大部分聽力障礙的原因，揭示遺傳性聽力障礙的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，對(duì)于指導(dǎo)醫(yī)學(xué)干預(yù)、評(píng)估兒童聽覺障礙的康復(fù)效果及預(yù)后有著重要作用。遺傳性耳聾基因突變形態(tài)復(fù)雜多樣，有明顯的地域特征，固定的篩查基因與位點(diǎn)模板可能存在一定局限性。但基于耳聾基因的廣泛性及檢測(cè)價(jià)格成本等因素，在實(shí)際工作中無法實(shí)現(xiàn)對(duì)所有基因及位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，最有效的方式應(yīng)是針對(duì)本地區(qū)的耳聾基因流行情況制定本區(qū)域檢測(cè)的基因與位點(diǎn)模板。本研究對(duì)遺傳性耳聾基因不同的檢測(cè)策略進(jìn)行分析，以期尋找一種科學(xué)、合理、經(jīng)濟(jì)且檢出率高的篩查策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月經(jīng)本院聽力中心聽力學(xué)檢測(cè)及影像學(xué)檢查（包括耳科常規(guī)檢查、純音測(cè)聽或聽性腦干反應(yīng)、耳聲發(fā)射、聲導(dǎo)抗、顳骨CT 及MR 等）確診為永久神經(jīng)性聽力損失以及同期濰坊市聾校全部聾生合計(jì)非綜合征型聾者391 例，男216 例、女175 例，年齡0.2～17（4.4 ±2.8）歲。患兒或監(jiān)護(hù)人在耳鼻喉科醫(yī)師指導(dǎo)下完成“非綜合征型聽力障礙者遺傳性耳聾基因檢測(cè)調(diào)查問卷”后進(jìn)行基因檢測(cè)，調(diào)查內(nèi)容包括一般信息、分娩情況、聽障高危因素、家族史、疾病史等。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，由患者本人或法定監(jiān)護(hù)人簽署《遺傳性耳聾基因檢測(cè)知情同意書》。

1.2 方法 391 例患兒采用隨機(jī)數(shù)字法分成A 組132 例、B 組142 例、C 組117 例，分別進(jìn)行不同遺傳性耳聾熱點(diǎn)基因及位點(diǎn)檢測(cè)。A 組進(jìn)行遺傳性耳聾基因熱點(diǎn)基因中的4個(gè)基因（GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA）21 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。B 組進(jìn)行遺傳性耳聾熱點(diǎn)基因6 個(gè)基因（GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA、POU3F4、GJB6）41 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。C 組進(jìn)行遺傳性耳聾熱點(diǎn)基因14 個(gè)基因（GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA、PRPS1、COCH、DFNAS、DIABLO、DSPP、TECTA、TMC1、GPR98、MYO15A、MYO7A）108 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜法，所有檢出突變病例通過Sanger 一代測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)各組GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA 基因突變頻次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較各組基因突變率以及GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA 基因突變頻次。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組基因突變情況 三組不同攜帶類型突變基因及突變位點(diǎn)發(fā)生情況見表1。

2.2 基因突變病例Sanger 一代測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 對(duì)3 種檢測(cè)方式顯示存在基因突變的113 例非綜合征型耳聾患者進(jìn)行Sanger 一代測(cè)序法驗(yàn)證，其結(jié)果與Sanger 一代測(cè)序檢測(cè)均一致，二者的總符合率為100%，Kappa=1。

2.3 三組不同基因突變類型發(fā)生例數(shù)及總體突變率 各組間總體檢出率差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表2。

表1 三組基因突變檢測(cè)結(jié)果比較

表2 三組不同基因突變類型發(fā)生例數(shù)及總體突變率比較

2.4 三組GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA 基因突變頻次及基因突變率 三種檢測(cè)方式比較患兒GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA 基因突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 三組GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA基因突變頻次比較

3 討論

先天性耳聾是最常見的出生缺陷之一，也是最常見的人類感覺系統(tǒng)疾病，發(fā)病率為0.1%～0.3%。研究表明遺傳因素造成的耳聾占全部耳聾患者的60%～70%，其中約30%為綜合征型耳聾，70%為非綜合征型耳聾［1］。非綜合征型耳聾患者臨床上僅出現(xiàn)聽覺功能障礙，不伴隨其他器官和系統(tǒng)異常，其發(fā)病率約為1‰。非綜合征型耳聾患者中常染色體隱性遺傳常見基因有GJB2、SLC26A4、GJB3、GPR98、TMC1、MYO7A、MYO15A等，占75%～80%；常染色體顯性遺傳常見基因有GJB3、DSPP、DFNA5、TECTA、DIABLO、COCH 等，占15%～20%；線粒體母系遺傳常見基因有MT-RNR1、MT-CO1、MT-TL1、MT-TS1、MT-TH 等，約占1%；X 連鎖的遺傳性耳聾常見基因有PRPS1等，占2%～5%。目前已知的致病非綜合征型耳聾基因175 個(gè)，并有新的突變基因不斷被發(fā)現(xiàn)［2］。耳聾基因檢測(cè)能夠?yàn)槎@患者提供病因分析、干預(yù)方法、治療策略、預(yù)防措施、生活方式，并可評(píng)估下一代的遺傳風(fēng)險(xiǎn)以預(yù)防耳聾發(fā)生［3-4］。遺傳性耳聾基因篩查目前應(yīng)用的篩查模式多為熱點(diǎn)基因篩查，我國遺傳性NSHL的最常見致病基因中GJB2、SLC26A4、GJB3、12SrRNA 4 個(gè)基因所占的比例較高，上述基因突變攜帶率分別為3.01%、2.02%、0.37%、0.19%，總的攜帶率約為6%［5］，以上4 個(gè)基因突變涵蓋遺傳非綜合征型突變基因的80%左右。常見的突變模式有錯(cuò)義突變、無義突變、移碼、插入和缺失等。

GJB2 基因編碼的Cx26 表達(dá)于耳蝸，位于內(nèi)耳血管紋、基底膜和螺旋緣，先天性遺傳性重度耳聾中大約50%與GJB2 基因突變相關(guān)。對(duì)遺傳性耳聾以往的研究認(rèn)為，GJB2 基因突變后，K+進(jìn)入內(nèi)淋巴液的循環(huán)受影響，導(dǎo)致常顯或常隱感音神經(jīng)性耳聾（DFNB1 或DFNA3）。但也有新的研究認(rèn)為GJB2 的致病機(jī)制為柱細(xì)胞中微管的減少可能導(dǎo)致螺旋器隧道開放失敗，且畸形的指突可能對(duì)螺旋器的支持框架產(chǎn)生負(fù)面影響［6］。GJB2 復(fù)合雜合突變主要影響耳蝸側(cè)壁的間隙連接功能，減弱耳蝸側(cè)壁的雜合耦合，降低耳蝸電位導(dǎo)致耳聾。另有研究認(rèn)為慢性產(chǎn)前缺氧可導(dǎo)致耳蝸Corti器毛細(xì)胞數(shù)量減少，Cx26蛋白和mRNA 水平降低，增加基因啟動(dòng)因子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，啟動(dòng)因子區(qū)超甲基化和Cx26表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致耳聾發(fā)生［7］。

SLC26A4 基因編碼Pendrin 蛋白質(zhì)，該蛋白是一種跨膜碘/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有高度疏水性。Pendrin蛋白質(zhì)功能障礙，可引起Cl－轉(zhuǎn)運(yùn)障礙或內(nèi)耳淋巴液流動(dòng)異常，引起前庭水管擴(kuò)大和內(nèi)淋巴管內(nèi)壓升高，內(nèi)耳毛細(xì)胞受損和聽神經(jīng)萎縮，從而導(dǎo)致聽力下降，是引起中國人大前庭水管綜合征主要原因。目前發(fā)現(xiàn)該基因的突變類型有500 多個(gè)，且具有顯著的種族和地域性［7］。該基因某些突變可導(dǎo)致抗sigma 拮抗劑結(jié)構(gòu)中581 號(hào)氨基酸位點(diǎn)上的p. R581M轉(zhuǎn)變，影響SLC26 蛋白穩(wěn)定性及功能。某些位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中氨基酸p.Glu704Gln轉(zhuǎn)變，改變Pendrin 蛋白的結(jié)構(gòu)；其構(gòu)象的隨機(jī)性增加，減弱了Pendrin蛋白陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體活性。也有研究認(rèn)為該基因部分位點(diǎn)突變，存在與GJB2基因突變協(xié)同致病的可能性［8］。

GJB3 基因?yàn)槲覈募逸x院士發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)耳聾相關(guān)基因，編碼縫隙連接蛋白Cx31，內(nèi)淋巴鉀離子循環(huán)障礙，導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞功能受損，該基因突變可致常染色體顯性和隱性非綜合征耳聾［7］。起病于青少年期或成人期，通常僅為進(jìn)行性高頻聽力受損，少部分患者會(huì)有中、重度耳聾。最近有研究認(rèn)為GJB3 基因編碼的Cx31 蛋白與GJB2 基因編碼的Cx26 蛋白協(xié)同導(dǎo)致耳聾［9］。當(dāng)GBJ3 基因中c.284C＞T 位點(diǎn)與GJB2 基因同時(shí)突變時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致耳聾發(fā)生。而有研究認(rèn)為傳統(tǒng)的c.538C＞T 位點(diǎn)對(duì)聽力影響較小。

線粒體基因突變呈母系遺傳，依據(jù)其在同一個(gè)體細(xì)胞和組織中的一致程度分為同質(zhì)性和異質(zhì)性。線粒體基因1494C＞T、1555A＞G、7444G＞A 突變與氨基糖甙類藥物致聾和非綜合征性耳聾有關(guān)。帶有突變的個(gè)體對(duì)耳毒性藥物（氨基糖苷類藥物）的敏感性高于正常人，小劑量即可誘發(fā)耳聾，通常是高頻聽力受損，少數(shù)患者聽力嚴(yán)重受損。線粒體基因突變存在閾值效應(yīng)，當(dāng)線粒體基因突變數(shù)量達(dá)到某個(gè)閾值時(shí)，可引起相應(yīng)的臨床癥狀，癥狀輕重與基因缺陷的嚴(yán) 重 程 度 有 關(guān)［10］。有 研 究 認(rèn) 為tRNAser（UCN）基 因7444G＞A 或其他基因位點(diǎn)突變可能為12sRNA 基因1555A＞G 突變病理效應(yīng)的修飾因子，通過影響12sRNA基因1555A＞G功能致聾［11］。

本研究將391 例患者隨機(jī)分為三組，A 組檢測(cè)4基因21 個(gè)位點(diǎn)、B 組檢測(cè)6 個(gè)基因41 個(gè)位點(diǎn)、C 組檢測(cè)14個(gè)基因108個(gè)位點(diǎn)，此結(jié)果與四川、紹興等地區(qū)報(bào)告檢出率近似［12-13］，但與福建、貴州、等地區(qū)檢出率報(bào)告有差異［14-17］，此可能與地域性差異以及樣本量有關(guān)。三組檢測(cè)的基因因及位點(diǎn)均涵蓋了我國大部分地區(qū)熱點(diǎn)突變基因及位點(diǎn)的80%，而剩余的大約20%已知突變基因數(shù)量龐大，即使適量增加檢測(cè)基因和位點(diǎn)的數(shù)量，也不會(huì)明顯增加其檢出率，這可能是三組間檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因之一。本文還顯示，4 種常見檢測(cè)基因GBJ2、SLC26A4、GJB3、12sRNA 突變檢出率三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢測(cè)基因和位點(diǎn)增多并不能增加基因突變檢測(cè)的敏感性及特異性。因此從節(jié)約成本角度出發(fā)，成本較低的4基因21個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)用于聽力障礙耳聾基因篩查即基本能夠滿足本地需要。

目前，盡管有新的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn)，基因修復(fù)也取得一些進(jìn)展。有研究者利用基因編輯的方法，通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行基因編輯獲得基因缺陷動(dòng)物，可以對(duì)已有基因缺陷動(dòng)物進(jìn)行基因糾正［18］。但是，耳聾基因的致病機(jī)理還未完全闡明。無論是耳聾基因的篩查，還是耳聾相關(guān)外顯子檢查等相關(guān)診斷，都不能完全排除突變的遺漏。有部分耳聾基因篩查中的基因突變攜帶者經(jīng)診斷后確定為復(fù)合雜合突變，因此對(duì)于篩查出的耳聾基因突變攜帶耳聾患者應(yīng)盡可能排查內(nèi)含子和啟動(dòng)子周圍區(qū)域內(nèi)的突變［3］。當(dāng)然也有部分基因突變患者表現(xiàn)為遲發(fā)性耳聾或外顯不全，這可能是目前耳聾基因突變的基因型與表型間存在差異性的原因之一。根據(jù)目前對(duì)耳聾病因的了解，僅靠基因檢測(cè)來明確病因還不夠完善，耳聾的病因檢測(cè)還應(yīng)包括病史、孕史及家族史采集、影像學(xué)檢查、內(nèi)鏡檢查以及生化檢查等。對(duì)于聽力正常的突變攜帶者也不應(yīng)過度強(qiáng)調(diào)耳聾發(fā)生的可能性，以免加重突變攜帶者及家屬的心理負(fù)擔(dān)。