呂凱波，龔乃超

武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院（武漢 430065）

紅花籽，中藥稱“白平子”，是紅花（Carthamus tinctoriusL.）的種子[1]。紅花籽中含油率在35%～40%之間，去油后紅花籽粕無(wú)毒、無(wú)異味，粗蛋白質(zhì)含量在20%～60%之間，其中含有18種人體所需的氨基酸，其中8種為含量較高的必需氨基酸[2]，蛋白消化率為77%[3-4]。紅花籽粕還含有黃酮類、木脂素、糖苷、多酚以及苯丙烯酞-5-羥色胺等多種微量成分[5]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，極具商業(yè)開發(fā)價(jià)值和廣泛應(yīng)用空間。但目前一般作為廉價(jià)的肥料和飼料，利用率較低，其商業(yè)附加值不高。

利用食品級(jí)蛋白酶可直接獲得安全性高、活性好的酶解產(chǎn)物[6]，從而得到更豐富的食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和添加劑，是目前提高植物蛋白附加值常用的方法。國(guó)內(nèi)外通過(guò)酶解蛋白研究酶種類及其多肽分子量分布和產(chǎn)物功能特性的影響報(bào)道較多，希望通過(guò)酶改性，蛋白質(zhì)在其乳化性、乳化穩(wěn)定性等方面有顯著改善，進(jìn)而擴(kuò)大其在食品領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用[7]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)紅花籽粕蛋白營(yíng)養(yǎng)及提取方法、酶解工藝及制備抗氧化肽都有一定的研究基礎(chǔ)，前期也嘗試酶法水解籽粕為原料開發(fā)出多肽飲料[8]，此次試驗(yàn)期望通過(guò)不同酶解工藝得到酶解液，研究產(chǎn)物的穩(wěn)定性、抗氧化性功能，為進(jìn)一步開發(fā)紅花籽粕資源提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅花籽粕粉末（壓榨法提油后得到的紅花籽粕，干燥粉碎后，過(guò)孔徑0.425 mm篩）；中性蛋白酶（60 000 U/g，武漢市華生物技術(shù)有限公司）；木瓜蛋白酶（800 U/mg，源葉生物）；堿性蛋白酶（240 000 U/g，丹麥諾維信）；鐵氰化鉀（AR）；Tris（上海麥克林生化科技有限公司）。

HH-2恒溫水浴鍋（金壇市宏華儀器廠）；TG16-WS高速離心機(jī)（湘麓離心機(jī)儀器有限公司）；722E型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；RRH-A400型高速多功能粉碎機(jī)（上海緣沃工貿(mào)有限公司）；KQ-100E型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）JM-A2002型；電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅花籽粕化學(xué)成分分析[9]

粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法；粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏抽提法；水分含量的測(cè)定采用干燥恒重稱量法；灰分含量的測(cè)定采用馬弗爐灰化法；總糖含量的測(cè)定采用硫酸-酚法。

1.2.2 紅花籽粕酶解液的制備

采用表1中的酶解工藝對(duì)紅花籽粕進(jìn)行水解。

表1 5種蛋白酶酶解工藝

其中，樣品4超聲波輔助酶解工藝：5%紅花籽粕溶液在超聲頻率40 kHz、超聲溫度55 ℃條件下，超聲20 min后，加入木瓜蛋白酶酶解2 h。以底物質(zhì)量計(jì)酶活，于100 ℃水浴10 min滅酶，按4 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為紅花籽粕酶解液。

1.2.3 游離氨基氮含量測(cè)定

采用茚三酮比色法[14]。

1.2.4 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用Folin-酚法[15]。

1.2.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

采用濁度法[16]。

1.2.6 抗氧化性測(cè)定[17]

測(cè)定還原力、清除DPPH自由基能力和清除羥自由基能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花籽粕化學(xué)成分分析

由表2可知，紅花籽粕中粗蛋白含量接近40%，將其作為廉價(jià)的肥料和飼料會(huì)造成蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。采用1.2.2方法酶解籽粕，對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表2 紅花籽粕化學(xué)成分分析

2.2 酶解液游離氨基氮含量

以游離氨基氮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示?；貧w方程為y=0.006 1x+0.000 2，R2=0.998 6（＞0.99），表明線性關(guān)系較好。

圖1 游離氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線

將樣品測(cè)定的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算酶解液中游離氨基氮的含量，結(jié)果如圖2所示。樣品3中的游離氨基氮含量最低，樣品4和樣品5最高，樣品1和樣品2次之；樣品3的酶解液水解度最小，說(shuō)明木瓜蛋白酶與中性蛋白酶混合使用，水解效果不突出；樣品4和樣品5游離氨基氮最高，表明紅花籽粕在木瓜蛋白酶或中性蛋白酶酶解時(shí)較充分。樣品1和樣品4相比，樣品4游離氨基氮含量更高，說(shuō)明同一酶解工藝下，超聲波輔助處理紅花籽粕蛋白有利于提高酶解效果。

圖2 酶解液中游離氨基氮的含量

2.3 酶解液可溶性蛋白質(zhì)含量

以橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示?；貧w方程為y=0.052 6x+0.010 1，R2=0.997 9（＞0.99），表明線性關(guān)系較好。

圖3 可溶性蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

將樣品測(cè)定的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算酶解液中可溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖4所示。試驗(yàn)結(jié)果與游離氨基氮含量檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致，樣品3中可溶性蛋白質(zhì)含量最低，樣品4和樣品5最高，樣品1和樣品2次之。經(jīng)過(guò)相關(guān)性分析：5種酶解方式下游離氨基氮含量與可溶性蛋白質(zhì)含量呈極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.92；這是由于酶解的作用，蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈被逐漸切斷，可溶性蛋白大量增加，其中小分子的游離氨基氮也隨水解程度加深而增加[18]，由此推測(cè)此時(shí)水解液中小分子物質(zhì)中呈味物質(zhì)也會(huì)不斷增加。

通常認(rèn)為水解液中可溶性蛋白在一定程度上可以表征蛋白質(zhì)的水解度[19]。由圖3和圖4可知，游離氨基酸和可溶性蛋白趨勢(shì)一致，說(shuō)明不同蛋白酶酶解紅花籽粕得到的酶解產(chǎn)物、酶解效果均有明顯差異，其中超聲波輔助木瓜蛋白酶酶解工藝最佳，其次為中性蛋白酶酶解工藝。

圖4 酶解液中可溶性蛋白含量

2.4 酶解液乳化性及乳化穩(wěn)定性

由圖5可知，樣品2乳化性最好，樣品4和樣品3次之，樣品5和樣品1最差；說(shuō)明堿性蛋白酶水解紅花籽粕后形成乳狀液的能力最強(qiáng)，而水解度較高的樣品4次之；這可能是因?yàn)樗舛仍黾樱嚯臄?shù)量增加，疏水性氨基酸側(cè)鏈外露，蛋白質(zhì)分子中靜電荷數(shù)量上升，蛋白質(zhì)的乳化性在一定程度上增加；水解度較大時(shí)，當(dāng)端基數(shù)目增加到一定程度后，電荷繼續(xù)增大，親水性也隨著增加，吸附油滴能力下降，乳化性又降低[20]。

圖5 酶解液乳化性和乳化穩(wěn)定性

由圖5可知，樣品4和樣品5乳化穩(wěn)定性最好，樣品2次之，樣品1和樣品3最差。采用超聲波輔助木瓜蛋白酶酶解工藝的樣品乳化穩(wěn)定性最好；說(shuō)明水解作用降低了分子的體積，增加了離子化基團(tuán)的數(shù)量和分布，在形成乳狀液中液珠間吸引作用小于其間的排斥作用，二者不易聚結(jié)，因此酶解液乳化穩(wěn)定性較好[21]。

從乳化性和穩(wěn)定性二者結(jié)合來(lái)看，樣品4乳化性和乳化穩(wěn)定性要明顯好于樣品1，說(shuō)明超聲處理對(duì)其有影響，超聲波處理能改善蛋白質(zhì)在水溶液中的分散效果和蛋白質(zhì)的分子作用力。由圖4和圖5可知，不同蛋白酶酶解紅花籽粕得到的酶解產(chǎn)物，其乳化性和乳化穩(wěn)定性有明顯差異。一般說(shuō)來(lái)，水解液中含氮化合物及蛋白質(zhì)含量越高，樣品乳化穩(wěn)定性也高。

2.5 酶解液抗氧化性分析

抗氧化肽具有抑制生物大分子過(guò)氧化或清除體內(nèi)自由基的功能，食用安全性高等優(yōu)點(diǎn)，使其成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[22-23]。如表3所示，樣品4和樣品2還原力最好，樣品5次之，樣品3和樣品1最差，可能是因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)乃舛认?，有較多的活性氨基酸或肽類被釋放，具有較強(qiáng)的供氫或供電子的能力；樣品1和樣品4的DPPH自由基清除率最強(qiáng)，其次為樣品2和樣品5，樣品3最差；對(duì)于羥自由基清除率，樣品2和樣品4較好，其他3種相差不大。綜合對(duì)比3個(gè)抗氧化性指標(biāo)，樣品4最佳。這可能是因?yàn)樵诖藯l件下，水解度增加，具有抗氧化性活性肽段不斷被暴露出來(lái)。

表3 酶解液抗氧化性

3 結(jié)論

以紅花籽粕作為原料，對(duì)比不同酶解工藝下酶解產(chǎn)物的游離氨基氮、水溶性蛋白、乳化性及乳化穩(wěn)定性、抗氧化性。結(jié)果表明：2.5 g紅花籽粕在50 mL pH 6.5 PBS、4 800 U/g木瓜蛋白酶條件下，55 ℃超聲處理20 min，酶解2 h，各項(xiàng)指標(biāo)突出，此時(shí)游離氨基氮含量為535.52 μg/mL，可溶性蛋白含量為58.74 mg/mL，乳化性為1.26 m2/g，乳化穩(wěn)定性為162.77 min，還原力為0.054±0.007，DPPH自由基清除率達(dá)（54.02± 2.8）%，羥自由基清除率達(dá)（35.16±1.4）%。以上研究結(jié)果顯示，紅花籽粕經(jīng)酶解后有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、穩(wěn)定性及抗氧化性，可作為植物源蛋白質(zhì)類多肽類產(chǎn)品進(jìn)行開發(fā)利用。