謝勉姣， 周 鵬， 段 晶， 馬 秦， 王美青

（1. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔疾病國(guó)際聯(lián)合研究中心，空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院口腔解剖生理學(xué)教研室，2. 頜面外科，陜西 西安 710032；3. 佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007）

軟骨細(xì)胞死亡是骨關(guān)節(jié)炎主要的細(xì)胞學(xué)變化之一[1]，因此，軟骨細(xì)胞對(duì)力刺激的生物學(xué)響應(yīng)規(guī)律備受關(guān)注。 顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的主要功能之一是負(fù)重，生理性力刺激可促進(jìn)髁突軟骨的正常代謝活動(dòng)，而異常力刺激則會(huì)影響細(xì)胞的正常功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。 我們課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，不同強(qiáng)度的流體剪切力（FFSS）可以導(dǎo)致大鼠髁突軟骨細(xì)胞出現(xiàn)不同的生物學(xué)響應(yīng)[3-4]。

整合素（Integrin）是重要的細(xì)胞表面跨膜受體，其胞內(nèi)區(qū)可以與骨架蛋白相接形成黏著斑，調(diào)節(jié)其與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的結(jié)合，并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。 肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Talin 1 是細(xì)胞黏著斑的重要調(diào)節(jié)因子， 介導(dǎo)著Integrin 與肌動(dòng)蛋白（F-actin）的相互聯(lián)系，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和斑點(diǎn)附著[6]。 當(dāng)整合素和Talin 1 與Factin 的結(jié)合因力刺激等原因而中斷，細(xì)胞便失去與ECM 的聯(lián)系， 過(guò)表達(dá)Bcl-2 家族中凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim， 釋放線(xiàn)粒體雙層膜腔內(nèi)儲(chǔ)存的細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）， 活化細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路，激活Caspase-3，從而引發(fā)凋亡[7]。

Calpain 的活化可以激發(fā)其水解多種活性蛋白，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡等多種生理活動(dòng)[8-9]。 細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡可以激活Calpain，而鈣內(nèi)流是細(xì)胞對(duì)力刺激的早期響應(yīng)之一，鈣內(nèi)流增加可通過(guò)活化Calpain 亞基鈣結(jié)合位點(diǎn)， 引起Calpain 的構(gòu)象改變，促進(jìn)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白水解等效應(yīng)[10]。 本研究擬通過(guò)對(duì)軟骨細(xì)胞加載FFSS 引發(fā)細(xì)胞凋亡，觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化以及Calpain、Talin 和肌動(dòng)蛋白在此期間的變化情況， 以論證在FFSS 刺激作用下，軟骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 原代髁突軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及剪切力加載

取3 周齡雌性大鼠 （購(gòu)買(mǎi)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心）10 只，體式顯微鏡下小心剝離髁突表面的組織，暴露軟骨本體部分，分離大鼠髁突軟骨細(xì)胞，于高糖培養(yǎng)基（HyClone 公司，美國(guó)）中剪碎后，1 500 r/min 離心5 min，收集組織，使用5 mL 胰酶（HyClone 公司，美國(guó)）于37 ℃消化組織20 min，使用2 mg/mL Ⅱ型膠原酶（Thermo 公司，美國(guó)）于37 ℃下消化組織120 min，最終收集1 500 r/min 離心5 min后的沉淀， 使用新制含1%雙抗（HyClone 公司，美國(guó)），10%胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)）高糖培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)細(xì)胞，每2 天換1 次液。

將獲得的原代軟骨細(xì)胞接種于加力專(zhuān)用載玻片（Flexcell 公司，美國(guó)）上，隨機(jī)分為對(duì)照組（即0 h組）、加力0.5 h 組、加力1 h 組、加力2 h 組、加力4 h 組；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，使用Flexcell 流體力學(xué)加載機(jī)以16 dyn/cm2（1 dyn/cm2=0.1 Pa）的剪切力進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的刺激。

1.2 鈣離子含量檢測(cè)

根據(jù)試劑盒（Beyotime 公司，中國(guó)）說(shuō)明，制作鈣離子含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)， 然后使用試劑盒中100 μL 細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清液；Bradford 法（Beyotime 公司，中國(guó)）進(jìn)行蛋白濃度定量；設(shè)2 個(gè)重復(fù)孔，每個(gè)樣本取5 μL，使用去離子水補(bǔ)齊至50 μL；每孔加入150 μL 新制檢測(cè)工作液（檢測(cè)緩沖液∶顯色液=1∶1），室溫避光孵育10 min；酶標(biāo)儀（Eppendorf 公司，德國(guó)）檢測(cè)575 nm 處吸光度值。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出每孔中鈣離子的含量，根據(jù)蛋白濃度換算1 μg 總蛋白細(xì)胞中含有的鈣離子量。

1.3 Calpain 活性檢測(cè)

根據(jù)試劑盒（BioVision 公司，美國(guó)）說(shuō)明，使用試劑盒中細(xì)胞裂解液100 μL 收集細(xì)胞，冰浴20 min后10 000×g離心1 min， 取上清液；Bradford 蛋白濃度定量后，取50 μg 總蛋白，使其體積為85 μL；設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，每個(gè)樣本內(nèi)加入10 μL 10×反應(yīng)液和5 μL Calpain 底物；避光37 ℃孵育1 h；使用熒光酶標(biāo)儀（Perkin Elmer 公司，美國(guó)）讀取激發(fā)波長(zhǎng)400 nm、發(fā)射波長(zhǎng)505 nm 的熒光值。

1.4 細(xì)胞熒光染色

用磷酸緩沖鹽溶液 （phosphate buffer saline，PBS）清洗細(xì)胞2 次后，4%甲醛溶液室溫固定細(xì)胞10 min；PBS 沖洗3 次， 每次10 min，0.5% Triton X-100 溶液室溫下通透細(xì)胞5 min；PBS 沖洗3 次，每次10 min，TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽 （Yeasen Biotech公司，中國(guó)）工作液覆蓋住玻璃板上細(xì)胞，室溫避光孵育30 min；PBS 沖洗3 次，每次10 min，含4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗熒光淬滅封片劑（赫特生物公司，中國(guó)）封片；4 ℃避光保存，共聚焦顯微鏡（Nikon 公司，德國(guó)）下觀(guān)察細(xì)胞。

1.5 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）

于冰上使用200 μL 裂解液（BioVision 公司，美國(guó)）收集各組加載后的細(xì)胞，12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min 后取上清液。 Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg 總蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE） （BioBrad 公司，美國(guó)）分離蛋白，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyrinylidene fluoride，PVDF；Millipore 公司，美國(guó)）上后置于5%脫脂奶粉-TBST 封閉液中封閉60 min，稀釋抗體Talin（1∶2 000）、Integrin β1（1∶5 000）、Bim（1∶2 000）（Abcam 公司，美國(guó)），Bcl-2（1∶500）、β-actin（1∶4 000）（Proteintech 公司，美國(guó)），Cleaved-Caspase-3（1∶1 000；Affinity 公司，美國(guó)）后置于4 ℃過(guò)夜孵育PVDF 膜， 次日復(fù)溫30 min 后TBST 洗膜3 次， 每次10 min，HRP 二抗（Proteintech公司，美國(guó)）室溫孵育60 min 后TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 發(fā)光液（ZETA 公司，美國(guó)）顯色發(fā)光，使用Image Lab 軟件半定量分析圖像灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。 所有數(shù)據(jù)采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化情況

使用鈣離子檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞中鈣離子含量的檢測(cè)結(jié)果表明，16 dyn/cm2的FFSS 刺激0、0.5、1、2和4 h 后，蛋白總量為1 μg 的原代軟骨細(xì)胞中鈣離子的含量依次增加，于1 h 時(shí)達(dá)到峰值，并一直維持在較高水平（P＜0.001，圖1）。

圖1 原代軟骨細(xì)胞在16 dyn/cm2 的FFSS 刺激下，總蛋白含量為1 μg 的細(xì)胞中鈣離子含量在不同加力時(shí)長(zhǎng)下的變化情況Figure 1 Stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress, the changes of calcium content at different time points of 1 μg total protein primary chondrocytes

2.2 Calpain 活性變化

使用Calpain 活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與0 h組相比，加載0.5 h 后Calpain 的水解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度便明顯升高，1 h 時(shí)達(dá)到高峰， 2 h 后依然維持在較高的活力水平（P＜0.000 1），但4 h 時(shí)水解產(chǎn)物的熒光值降至0 h 組水平（P=0.151 8，圖2）。

圖2 不同時(shí)長(zhǎng)16 dyn/cm2 的FFSS 刺激下， 每50 μg 總蛋白含量的原代軟骨細(xì)胞內(nèi)Calpain 的活性變化Figure 2 Changes of calpain activity of 50 μg total protein primary chondrocytes stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress at different time points

2.3 細(xì)胞骨架變化

使用鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行熒光染色觀(guān)察，與0 h 組比較，剪切力刺激軟骨細(xì)胞0.5 h 時(shí)，細(xì)胞骨架表達(dá)量減少得并不明顯（P=0.1 147）；而在刺激1、2 和4 h 后， 細(xì)胞骨架的表達(dá)量隨加力時(shí)長(zhǎng)的增加而逐漸減少（P＜0.001，圖3）。

2.4 Western blot 檢 測(cè)Talin 1、Integrin β1、Bim、Bcl-2、和Cleaved-Caspase-3 的表達(dá)變化

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，Talin 1、Integrin β1和Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平與0 h 組相比， 逐漸降低（P＜0.01），而B(niǎo)im 及Cleaved-Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平與0 h 組相比明顯升高（P＜0.000 1，圖4）。

圖3 不同時(shí)長(zhǎng)16 dyn/cm2 的流體剪切力刺激下，細(xì)胞骨架F-actin 的變化情況Figure 3 The changes of cytoskeleton protein F-actin stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress at different time points

圖4 Western blot 檢測(cè)不同時(shí)長(zhǎng)16 dyn/cm2 的流體剪切力刺激下，Talin 1、Integrin β1、Bcl-2、Bim 以及Cleaved-Caspase3 的蛋白水平表達(dá)情況及其灰度值組間比較Figure 4 Comparison of the expression level and its gray-scale value of Talin 1，Integrin β1, Bcl-2, Bim and Cleaved-Caspase-3 proteins stimulated by 16 dyn/cm2 fluid flow shear stress at different time points observed by Western blot

3 討論

鈣信號(hào)是真核細(xì)胞中最原始的第二信使，能夠調(diào)控各種生理、生化過(guò)程[11-12]。 我們課題組早期的研究發(fā)現(xiàn)，在病理狀況下，存在于細(xì)胞膜表面的力敏感性半通道蛋白Cx43 會(huì)異?；钴S[13]，使得鈣離子以非選擇性方式自由出入細(xì)胞， 導(dǎo)致細(xì)胞離子失衡，出現(xiàn)細(xì)胞死亡[14]。

Calpain 是鈣信號(hào)的主要效應(yīng)分子之一，廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)和亞細(xì)胞器中，Calpain 常見(jiàn)的家族成員為Calpain1 和Calpain2， 微摩爾水平的Ca2+濃度即可激活Calpain，而毫摩爾水平的Ca2+才能激活Calpain2[15]；當(dāng)Calpain 被過(guò)量激活時(shí)，它將通過(guò)作用于凋亡相關(guān)的分子蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡以及骨組織細(xì)胞退變的病理過(guò)程，造成相應(yīng)組織器官的功能障礙[16]。 本研究中，F(xiàn)FSS 刺激組細(xì)胞內(nèi)鈣離子的含量明顯高于不加力的對(duì)照組。

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高后，Calpain 的活性將被過(guò)度激活。Calpain 的水解底物包括大多數(shù)的細(xì)胞骨架蛋白，如樁蛋白（Paxillin）、黏著斑蛋白（Vinculin）和踝蛋白（Talin）[17]；細(xì)胞骨架為細(xì)胞質(zhì)提供了力學(xué)結(jié)構(gòu)， 在機(jī)械壓力的傳導(dǎo)中起到核心作用，它的張力完整性直接影響細(xì)胞的形狀及功能[18]。 研究的結(jié)果表明，加力初期，作為細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，肌動(dòng)蛋白并未發(fā)生明顯的變化，1 h 后隨著加力時(shí)長(zhǎng)的推移其含量越來(lái)越少，Talin 蛋白的表達(dá)水平也呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明被激活的Calpain 降解骨架蛋白的活動(dòng)增強(qiáng)。

Talin 是一種黏附分子， 是構(gòu)成Integrin 和肌動(dòng)蛋白物理連接的重要成分。Talin 與肌動(dòng)蛋白相互作用保持黏著斑穩(wěn)定，Talin 與Integrin 相結(jié)合， 誘導(dǎo)Integrin 胞外段親和力改變，觸發(fā)Integrin 形成細(xì)胞黏附[19]。本文的研究結(jié)果表明，在FFSS 刺激下，胞內(nèi)大量的Talin 蛋白被Calpain 水解， 與其相結(jié)合的Integrin 表達(dá)水平也明顯減少，這可以導(dǎo)致Talin 與Integrin 在胞內(nèi)膜邊緣的黏著斑水解，細(xì)胞黏附作用減弱，成為細(xì)胞凋亡的重要基礎(chǔ)。

Bcl-2 蛋白家族中，Bcl-2 基因是一種原癌基因，具有抑制凋亡的作用， 而B(niǎo)im 蛋白在Bcl-2 蛋白家族中行使的卻是相反的作用——促進(jìn)凋亡作用，Bcl-2 蛋白的表達(dá)量降低， 凋亡相關(guān)分子Bim 蛋白高表達(dá)， 均利于促進(jìn)Bax-Bak 復(fù)合體于線(xiàn)粒體膜上形成孔道，破壞線(xiàn)粒體外膜的完整性，釋放Cyt C，活化細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路，使凋亡執(zhí)行分子Caspase-3開(kāi)始工作， 生成大量Caspase-3 執(zhí)行功能活化形式的Cleaved-Caspase-3[20]。 本文的研究結(jié)果表明，F(xiàn)FSS作用下Calpain 的水解作用增強(qiáng)， 使得黏著斑被大量水解，激活細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性凋亡通路，最終激活凋亡執(zhí)行分子Caspase-3 而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究中Calpain 活性于加力4 h 時(shí)降至與對(duì)照組無(wú)差異，可能是由于細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間異常力刺激后進(jìn)入凋亡期，細(xì)胞合成蛋白的能力受到明顯的影響所致。 雖然FFSS 刺激4 h 后Calpain 的活性降低，但凋亡活動(dòng)一直保持在較高的水平。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)原代髁突軟骨細(xì)胞施加不同時(shí)長(zhǎng)的流體剪切力刺激，使得胞內(nèi)鈣信號(hào)持續(xù)高度響應(yīng)，進(jìn)而活化細(xì)胞內(nèi)Calpain，使其水解功能增強(qiáng)，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Talin 被水解，進(jìn)而引起細(xì)胞黏著斑松動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。