蔡孟成，金永生

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433)

同病異治是指對(duì)于同一疾病，因人、因地、因時(shí)的不同，或由于病情的發(fā)展、病型的各異、病機(jī)的變化差異，治療時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的情況采用不同的治療方法[1]。新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是一種急性感染性肺炎，重型患者可出現(xiàn)呼吸困難、高熱神昏等癥狀，危重型患者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征或膿毒血癥。目前，COVID-19診療方案中采用熱毒寧、血必凈注射液對(duì)重型和危重型患者進(jìn)行治療[2]，熱毒寧處方由金銀花、青蒿、梔子組成，功效以清熱解毒為主；血必凈處方由丹參、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎組成，功效以涼血活血為主。這兩種注射液的藥物組成差異較大，但都對(duì)COVID-19有確切療效。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究熱毒寧和血必凈“同病異治”COVID-19的可能作用機(jī)制，以期為COVID-19的治療及相關(guān)藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥物成分與靶點(diǎn)的篩選 本研究采用計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 檢索熱毒寧(處方中含金銀花、青蒿、梔子)與血必凈(處方中含丹參、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎)的潛在活性成分。根據(jù)化合物口服生物利用度≥30%與類藥性≥0.18進(jìn)行篩選，并利用TCMSP獲取這些潛在活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)[3]。

1.2 COVID-19靶點(diǎn)的收集 分別以“novel coronavirus pneumonia”、“COVID-19”、“SARS-Cov-2”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)，獲取COVID-19的靶點(diǎn)，將檢索到的靶點(diǎn)進(jìn)行交集，將交集靶點(diǎn)作為研究對(duì)象。

1.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn) 將1.1項(xiàng)的熱毒寧靶點(diǎn)與1.2項(xiàng)的COVID-19靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得熱毒寧和COVID-19交集靶點(diǎn)；將1.1項(xiàng)的血必凈靶點(diǎn)與1.2項(xiàng)的COVID-19靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得血必凈和COVID-19交集靶點(diǎn)。再將兩部分交集靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得的交集靶點(diǎn)作為兩藥治療COVID-19的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 為了進(jìn)一步明確COVID-19同病異治的機(jī)制，利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建出化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，將活性成分與靶點(diǎn)的作用關(guān)系可視化。

1.5 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 為了明確靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將熱毒寧和血必凈治療COVID-19的交集靶點(diǎn)上傳至線上軟件String10.5 (http://stringdb.org)，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。物種選擇為 Homosapiens，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系以及度值，利用Cytoscape 3.6.1軟件將結(jié)果可視化。

1.6 KEGG富集分析 利用Cytoscape 3.6.1軟件中的ClueGo功能將熱毒寧和血必凈治療COVID-19的交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，選擇P<0.05并且通路內(nèi)最少含有7個(gè)熱毒寧和血必凈治療COVID-19交集靶點(diǎn)的通路，將結(jié)果可視化。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/)獲取熱毒寧和血必凈治療COVID-19的交集靶點(diǎn)的信號(hào)通路圖。

1.7 分子對(duì)接 利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索1.4項(xiàng)下高度值的活性成分，利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www1.rcsb.org/)檢索新型冠狀病毒產(chǎn)生的主要蛋白酶(3CLpro)的蛋白結(jié)構(gòu)(PDB：6LU7)。利用Openbabel軟件將活性成分由SDF格式文件轉(zhuǎn)換為PDBQT格式文件，作為對(duì)接配體；將3CLpro蛋白結(jié)構(gòu)在Pymol中刪除配體，在AutoDock軟件中進(jìn)行去水、加氫、計(jì)算電荷操作，作為對(duì)接受體。利用AutoGrid軟件與AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并用Pymol軟件將結(jié)構(gòu)可視化。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分與靶點(diǎn)獲取 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到熱毒寧和血必凈中的潛在活性成分：金銀花236個(gè)，青蒿126個(gè)，梔子98個(gè)，丹參202個(gè)，當(dāng)歸125個(gè)，紅花189個(gè)，川芎189個(gè)，赤芍119個(gè)。根據(jù)口服生物利用度和類藥性篩選后，獲得潛在活性成分：金銀花23個(gè)，青蒿22個(gè)，梔子15個(gè)，丹參65個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，紅花22個(gè)，川芎7個(gè)，赤芍29個(gè)。獲得COVID-19靶點(diǎn)1751個(gè)，其中熱毒寧的藥物靶點(diǎn)702個(gè)，血必凈的藥物靶點(diǎn)1049個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，獲得熱毒寧靶點(diǎn)196個(gè)，血必凈靶點(diǎn)217個(gè)。

2.2 COVID-19靶點(diǎn)的獲取 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得COVID-19靶點(diǎn)438個(gè)。

2.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)的獲取 將2.1項(xiàng)下196個(gè)熱毒寧中藥靶點(diǎn)與2.2項(xiàng)下438個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得熱毒寧和COVID-19的交集靶點(diǎn)51個(gè)；將2.1項(xiàng)下217個(gè)血必凈中藥靶點(diǎn)與2.2項(xiàng)下438個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得血必凈和COVID-19的交集靶點(diǎn)56個(gè)。將兩部分靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得51個(gè)相同靶點(diǎn)，血必凈較熱毒寧多5個(gè)單獨(dú)靶點(diǎn)。熱毒寧、血必凈中藥靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的維恩圖見(jiàn)圖1。

2.4 活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 (見(jiàn)圖2)， 該圖中共有129個(gè)節(jié)點(diǎn)，330條邊。其中藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)51個(gè)， 代表熱毒寧、血必凈的公共靶點(diǎn)； 黃色圓形節(jié)點(diǎn)5個(gè)，代表血必凈獨(dú)有的靶點(diǎn)；紅色方形節(jié)點(diǎn)65個(gè)，代表血必凈獨(dú)有的活性成分；綠色方形節(jié)點(diǎn)24個(gè)，代表熱毒寧獨(dú)有的活性成分；紫色方形節(jié)點(diǎn)8個(gè)，代表血必凈與熱毒寧共有的活性成分。度值較高的活性成分包括：木犀草素、槲皮素、山奈酚、黃芩素、異鼠李素，其度值分別為43、20、14、9、8；度值較高的靶點(diǎn)包括：PTGS2、PTGS1、NOS2、PPARG、GSK3B，其度值分別為91、47、25、23、18。

圖1 熱毒寧、血必凈中藥靶點(diǎn)與COVID-19疾病靶點(diǎn)的維恩圖

圖2 熱毒寧、血必凈活性成分與COVID-19的疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建熱毒寧、血必凈與COVID-19公共靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖3)，圖中有51個(gè)節(jié)點(diǎn)，690條邊。圖中的節(jié)點(diǎn)越大、顏色越紅表明靶點(diǎn)的度值越高，靶點(diǎn)作用越關(guān)鍵。度值排名前10位的靶點(diǎn)是：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(VEGF-A)、胱天蛋白酶3(CASP3)、白介素6(IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK8、ALB、CXCL8、IL-10、CCL2、PTGS2，其度值分別為47、43、43、41、41、40、39、39、38、38。

2.6 KEGG富集分析結(jié)果 KEGG富集分析結(jié)果表明，熱毒寧、血必凈與COVID-19交集的公共靶點(diǎn)主要參與了糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、恰加斯病、百日咳、IL-17信號(hào)通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。其中富集程度最高的糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路，包括Jak-STAT信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等(見(jiàn)圖4)。

圖3 公共靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接 以木犀草素、槲皮素、山奈酚作為對(duì)接配體，3CLpro作為對(duì)接受體，分子對(duì)接結(jié)果表明木犀草素與3CLpro的結(jié)合能為-1.96 kJ/mol，槲皮素與3CLpro的結(jié)合能為-2.30 kJ/mol，山奈酚與3CLpro的結(jié)合能為-3.83 kJ/mol。山奈酚與3CLpro的對(duì)接能力最強(qiáng)。三種化合物與3CLpro的對(duì)接模式圖見(jiàn)圖5。

3 討 論

COVID-19主要由新型冠狀病毒感染引起，抗病毒是治療病毒性感染的基本策略，目前研究的抗擊COVID-19藥物主要是通過(guò)3CLpro受體及跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)以抑制病毒侵入、病毒膜融合，或抑制SARS-CoV-2的3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶的活性[4]。現(xiàn)代研究表明，熱毒寧注射液有廣譜抗病毒作用，可治療病毒性肺炎、手足口病、皰疹性咽峽炎等多種病毒感染性疾病[5-7]。循證醫(yī)學(xué)研究表明，熱毒寧注射液可以縮短病毒性肺炎患者的退熱時(shí)間、啰音消失時(shí)間和咳喘消失時(shí)間，提高治療有效率[8]。血必凈注射液和抗病毒藥物聯(lián)合使用也可提高COVID-19患者的治療效果[9]。熱毒寧注射液和血必凈注射液有明確的臨床療效，但其物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚不明確，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究其共有的活性物質(zhì)與作用機(jī)制，對(duì)臨床應(yīng)用與新藥研發(fā)具有重大意義。

圖4 公共靶點(diǎn)的KEGG富集分析圖

圖5 化合物與3CLpro (PDB:6LU7)對(duì)接作用模式

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，熱毒寧注射液和血必凈注射液公共的且度值較高的靶點(diǎn)包括VEGF-A、CASP3、IL-6。VEGF-A在組織纖維化，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、存活和血管通透性的維持等多種生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，COVID-19可導(dǎo)致患者肺纖維化[10]，熱毒寧和血必凈可能是通過(guò)調(diào)控VEGF-A抑制肺纖維化，從而改善患者的肺部癥狀。CASP3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，作者推測(cè)熱毒寧和血必凈可能是通過(guò)抑制CASP3抑制肺泡細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)肺功能恢復(fù)。IL-6與炎癥密切相關(guān)，熱毒寧和血必凈可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而起到解熱鎮(zhèn)痛、止咳平喘的作用。Jak-STAT信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等可能是熱毒寧和血必凈作用的相關(guān)通路，這些通路主要與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、纖維化相關(guān)，提示抑制炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、抑制肺纖維化可作為COVID-19的輔助治療方法。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，熱毒寧和血必凈共有的成分包括木犀草素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素和植物甾醇等。研究表明，山奈酚和槲皮素具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)臟器的作用[11]。木犀草素對(duì)多種病毒的感染具有抑制作用，主要通過(guò)影響病毒感染宿主細(xì)胞中激酶或轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；或者直接對(duì)病毒產(chǎn)生抑制作用[12]。異鼠李素也具有明確的抗病毒作用，可提高小鼠的抗病毒能力，并提高小鼠病毒感染后的生存率[13]。進(jìn)一步的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、山奈酚和3CLpro具有一定的結(jié)合能力，但其結(jié)合能較弱，這也證實(shí)了黃酮類小分子化合物具有多靶點(diǎn)但作用弱的特點(diǎn)，這提示在日后的應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)當(dāng)提高黃酮類化合物的劑量，從而提高臨床療效。此外，大量研究表明植物甾醇可以參與免疫調(diào)節(jié)并發(fā)揮抗炎作用，降低促炎細(xì)胞因子的含量，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，提示其主要是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而改善COVID-19患者的癥狀[14]。

綜上所述，熱毒寧和血必凈由于組方差異，在抗COVID-19靶點(diǎn)方面既有相同也有不同。本研究通過(guò)對(duì)VEGF-A、CASP3、IL-6、MAPK1、MAPK8等共有靶點(diǎn)闡釋COVID-19“同病異治”中的“同病”，通過(guò)對(duì)NPM1、STAT3、CAT、APOD、CD14特有靶點(diǎn)闡釋COVID-19“同病異治”中的“異治”。上述預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與已有文獻(xiàn)報(bào)道的藥理作用相吻合，表明預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性。此外，關(guān)于上述討論中剩余靶點(diǎn)的相關(guān)研究報(bào)道較少，這可為今后深入研究抗COVID-19潛在靶點(diǎn)的分子作用機(jī)制提供線索。