盧 杰，李 雪，王 璐，范 佳，盧曉斌，張業(yè)廷，張樹玲，袁瓊嘉

（1.成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，四川成都610041；2.蘇州市體育科學(xué)研究所，江蘇蘇州215131；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，四川雅安625014）

空間學(xué)習(xí)和記憶是指動(dòng)物通過(guò)編碼環(huán)境信息來(lái)促進(jìn)空間導(dǎo)航，是回憶關(guān)聯(lián)刺激位置的一個(gè)過(guò)程［1］，主要依賴海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)周圍區(qū)的完整性［2］。不過(guò)有研究表明，小腦除了維持運(yùn)動(dòng)姿勢(shì)平衡和運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)以外［3］，還參與空間學(xué)習(xí)和記憶［4］?；蚯贸夹g(shù)進(jìn)一步揭示，小鼠小腦蒲肯野細(xì)胞損傷后，其空間學(xué)習(xí)和記憶能力出現(xiàn)障礙［5］。學(xué)習(xí)和記憶可引起突觸的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其結(jié)構(gòu)可塑性主要表現(xiàn)為突觸的增長(zhǎng)和缺失［6］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）屬于免疫球蛋白超家族中的一種細(xì)胞表面大分子，它對(duì)學(xué)習(xí)記憶的形成和神經(jīng)突觸可塑性具有重要的影響［7］。有研究證明，NCAM基因敲除后，小鼠表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)障礙［8］；對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮模擬訓(xùn)練后，大鼠NCAM的表達(dá)量在可塑性腦區(qū)出現(xiàn)上調(diào)，其空間學(xué)習(xí)記憶能力穩(wěn)步提高［9］。

有氧運(yùn)動(dòng)可改善和增強(qiáng)人的認(rèn)知能力［10］，規(guī)律合理的運(yùn)動(dòng)甚至可以減輕腦損傷，促進(jìn)腦的空間學(xué)習(xí)記憶能力［11］。在基礎(chǔ)研究方面，多數(shù)研究關(guān)注運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬NCAM表達(dá)的影響，長(zhǎng)期中等和大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可以提高大鼠海馬NCAM表達(dá)［12-13］，但有氧訓(xùn)練調(diào)控大鼠小腦NCAM表達(dá)并不明確。因此，本研究通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行8周不同負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察運(yùn)動(dòng)建模后小腦NCAM的變化情況，分析不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，探索有氧訓(xùn)練影響大鼠小腦學(xué)習(xí)和記憶能力的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)進(jìn)30只（SPF）級(jí)Sprague Dawley（SD）大鼠（成都達(dá)碩公司），2月齡雄性，體重（298±19）g，許可證號(hào)：CSXK（川）2008-24，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)成都體育學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將大鼠放置在本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房，室溫為（26±3）℃。分籠飼養(yǎng)，3～4只/籠，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)原則進(jìn)行飼養(yǎng)，正常飲水，自由攝食，自然光照并保持通風(fēng)，確保動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室清潔衛(wèi)生。

1.1.2 儀器和試劑

Morris水迷宮裝置與測(cè)試系統(tǒng)購(gòu)自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。大鼠睪酮ELISA實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，NCAM1小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)OriGene公司，苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，蛋白質(zhì)分子量Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，焦碳酸二乙酯購(gòu)自上海一研生物科技有限公司，RNA提取液購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeiaTM公司，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR混合液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，NCAM引物、β-actin引物均由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)方法

首先對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，共3 d，接著進(jìn)行1 d的定位航行實(shí)驗(yàn)。然后把大鼠隨機(jī)分為正常組（control，n=10）、中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（moderate-load training，MT，n=10）和高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（high-load training，HT，n=10）。正常組無(wú)運(yùn)動(dòng)干預(yù)、正常進(jìn)食，高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組和中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組分別進(jìn)行游泳訓(xùn)練干預(yù)。游泳裝置為玻璃缸（150 cm×60 cm×100 cm），水溫（34±2）℃，水深80 cm。大鼠具體的游泳運(yùn)動(dòng)建模方案：中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（6 d/周+1次/d+第1 d下水游10 min+每天累加5 min+第1周末訓(xùn)練30 min+第2周末訓(xùn)練60 min+第3周至第8周60 min/d）；高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組（6 d/周+1次/d+第1 d下水游10 min+每天累加5 min+第2周末訓(xùn)練60 min+第3周末訓(xùn)練120 min+第4周至第8周120 min/d+第4周大鼠斜挎附加自身體重1%含有螺帽的尼龍繩訓(xùn)練+之后附加重量每周遞增1%至第8周大鼠負(fù)自身體重5%）。

1.2.2 Morris水迷宮

本研究選用Morris水迷宮系統(tǒng)評(píng)測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力［14］。Morris水迷宮池呈圓柱狀，人為地將圓形池劃分為4個(gè)象限，在第4象限中心處設(shè)置一個(gè)站臺(tái)，直徑為12 cm，低于水面2 cm，池水用碳素墨水染黑。水迷宮邊緣用簾子遮擋，設(shè)置線索提示，環(huán)境光線均勻且暗淡。定位航行實(shí)驗(yàn)持續(xù)1周，大鼠自由游泳，直到在120 s內(nèi)找到第4象限的圓形平臺(tái)，準(zhǔn)許大鼠在圓臺(tái)上歇息10 s，系統(tǒng)會(huì)記錄大鼠從入水至探尋到圓形支撐臺(tái)所用的時(shí)間；如果在120 s內(nèi)沒(méi)有探索到圓臺(tái)，科研人員應(yīng)將大鼠導(dǎo)引至圓形平臺(tái)，歇息10 s，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠的潛伏耗時(shí)計(jì)為120 s。水池的上方有攝影機(jī)全程采集大鼠的活動(dòng)影像，電腦系統(tǒng)則可追蹤大鼠的游泳軌跡等數(shù)據(jù)。隨后將支撐臺(tái)拆除，入水點(diǎn)設(shè)置在第2象限，大鼠依次進(jìn)行1 d的空間探索實(shí)驗(yàn)。參考線索提示，大鼠憑記憶去探尋原支撐平臺(tái)，電腦系統(tǒng)軟件則可計(jì)算60 s內(nèi)大鼠穿越原支撐臺(tái)所處位置次數(shù)。

1.2.3 血液收集和小腦組織樣本采集

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠斷頭，取血于EP管中，室溫靜置1 h后離心，分別取出血清，將其放置到-20℃冰箱保存。大鼠斷頭取血后，開(kāi)始進(jìn)行小腦組織樣本采集。齊耳縫剝出大鼠的腦組織在冰生理鹽水中漂洗，用濾紙拭干，將腦組織迅速轉(zhuǎn)移到錫箔紙上再分離小腦，裝進(jìn)凍存管，并置于液氮內(nèi)低溫凍存。

1.2.4 ELISA

按照實(shí)驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書的要求，準(zhǔn)備試劑，溶解或稀釋顯色劑（substrate solution）、清洗液（wash buffer）、睪酮標(biāo)準(zhǔn)品（testosterone standard），向96孔板子中加入抗體原溶液（primary antibody solution）、每個(gè)孔均50μl，將板子置于搖床上、搖勻1 h、最高轉(zhuǎn)速（500±50）r/min，洗滌4次，添加標(biāo)準(zhǔn)品并加樣，添加睪酮結(jié)合物（testosterone conjugate）、每孔50μl，保溫混勻，洗滌4次，然后加入substrate solution顯色、30 min，添加50μl stop solution至每孔、可以觀察到由藍(lán)色變?yōu)辄S色，30 min之內(nèi)進(jìn)行比色、測(cè)出OD值。用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，x軸表示標(biāo)準(zhǔn)值濃度，y軸代表標(biāo)準(zhǔn)值的OD值，最后計(jì)算出樣本的濃度。

1.2.5 real time RT-PCR

按照RNAzol試劑盒（GeneCopoeiaTM公司）說(shuō)明書，提取小腦總的RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度、濃度，參考iScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒（Bio-Rad公司）說(shuō)明書，逆轉(zhuǎn)錄RNA生成cDNA，在CFX Manager System上以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作。NCAM引物序列（上游：5'-ACTGGAACGCCGAGTACGAA-3'，下游：5'-TGACAATGAGGATGCCCACAA-3'）；β-actin引物序列（上游：5'-TGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3'，下 游：5'-TGCTAGGAGCCAGGGCAGTAA-3'）。設(shè)置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：2 min預(yù)變性、95℃，45 s變性、95℃下進(jìn)行35次循環(huán)，30 s退火、57.5℃下進(jìn)行35次循環(huán)，35 s延伸、72℃下進(jìn)行35次循環(huán)，5 min延伸、72℃。選用2-△△Ct方法計(jì)算NCAM mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Western Blot

依據(jù)試劑盒說(shuō)明書，配制含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，稱量小腦組織50 mg，冰上研磨，加1 000 μl RIPA裂解液冰上裂解小腦組織30 min，待蛋白變性后，提取小腦總蛋白，使用BCA混合液對(duì)小腦蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，按照目的蛋白的大小制作SDS聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)上樣，用梯度電泳分離蛋白，采用恒流濕轉(zhuǎn)法對(duì)小腦分離蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（電流400 mA，1 h），8%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h、室溫?fù)u勻，加NCAM1小鼠單克隆抗體一抗（1：1 000）4℃孵育并過(guò)夜、時(shí)間長(zhǎng)于8 h，TBST洗膜3次、每次10 min，加HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗（1：4 000）37℃孵育60 min，TBST洗膜3次、每次10 min，采用ECL法，暗室曝光膠片，先顯影后定影，漂洗膠片，完全干燥后用Quantity one軟件分析圖片。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS19.0分析數(shù)據(jù)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的對(duì)比采用單因素方差分析，計(jì)量資料按照均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，選用偏相關(guān)分析法（partial correlation）分析大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和小腦NCAM表達(dá)的相關(guān)性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.01表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 兩種游泳訓(xùn)練后大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力的變化

如圖1所示，Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組在第1 d的定位航行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中耗時(shí)較短，其平均逃避潛伏期顯著降低（P＜0.01），同時(shí)中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組平均潛伏耗時(shí)相較于高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組同樣顯著降低（P＜0.01）；而高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組和正常組第1 d的潛伏耗時(shí)相比，無(wú)顯著變化（P＞0.05）；第3 d之后，三組大鼠耗時(shí)趨于穩(wěn)定，平均潛伏耗時(shí)相差不大（P＞0.05）。Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2），和正常組對(duì)比，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠平均穿過(guò)原站臺(tái)位置的次數(shù)明顯提高（P＜0.05），與正常組和中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組相比，高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠平均穿越原站臺(tái)所處位置的次數(shù)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果提示，中等負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，但過(guò)高的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷使大鼠空間記憶能力出現(xiàn)衰退。

2.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)大鼠不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型是否成功，我們對(duì)大鼠的血睪酮含量進(jìn)行測(cè)定。ELISA結(jié)果顯示（見(jiàn)表1），與正常組、中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組比較，高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組血睪酮水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.01）；與正常組比較，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組血睪酮水平顯著升高（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，中等負(fù)荷和高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)造模成功。

表1大鼠血清睪酮水平（x±s）Table1 Level of serum testosteroneof rats（x±s）

圖1每組大鼠逃避潛伏期Figure 1 Escapelatency of each group of rats注：“*”：和“控制”比較，P＜0.01；“#”：和MT比較，P＜0.01。下同。

圖2大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)結(jié)果Figure 2 The results of passing times of rats

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠小腦NCAM mRNA表達(dá)的影響

real time RT-PCR結(jié)果顯示（見(jiàn)表2），中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組比正常組NCAM mRNA增高顯著（P＜0.05）；高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組NCAM mRNA與中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組對(duì)比，呈現(xiàn)出明顯地降低（P＜0.05），但和正常組NCAM mRNA比較，無(wú)明顯變化（P＞0.05）。表明中等負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)可使大鼠小腦NCAMmRNA表達(dá)增高。

表2各組大鼠小腦NCAM mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）Table 2 The relative expression of NCAM mRNA in cerebellum of each group of rats（x±s）

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠小腦NCAM蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3、表3），與正常組對(duì)比，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組小腦NCAM蛋白表達(dá)量顯著增高（P＜0.05）；和中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組對(duì)比，高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組小腦NCAM蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組小腦NCAM蛋白表達(dá)量與正常組對(duì)比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。表明中等負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)能顯著提高大鼠小腦NCAM蛋白表達(dá)。

圖3大鼠小腦NCAM蛋白表達(dá)條帶圖Figure 3 The band diagram of NCAM protein in cerebellum of rats

表3大鼠小腦NCAM蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s）Table 3 The relative expression of NCAM protein in cerebellum of rats（x±s）

2.5 小腦NCAM表達(dá)和大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力的相關(guān)性

采用偏相關(guān)分析，我們進(jìn)一步探索大鼠小腦NCAM的表達(dá)量和平均潛伏用時(shí)以及穿越站臺(tái)所處位置次數(shù)的關(guān)系。偏相關(guān)分析結(jié)果顯示：三組大鼠小腦中NCAM蛋白表達(dá)量和平均潛伏用時(shí)成負(fù)相關(guān)（r=-0.726，P=0.041）；三組大鼠小腦中NCAMmRNA表達(dá)量和平均潛伏用時(shí)成負(fù)相關(guān)（r=-0.750，P=0.032）；三組大鼠小腦中NCAM蛋白表達(dá)量和穿越站臺(tái)所處位置的次數(shù)成正相關(guān)（r=0.714，P=0.047）；三組大鼠小腦中NCAM mRNA表達(dá)量和穿越站臺(tái)所處位置的次數(shù)成正相關(guān)（r=0.774，P=0.024）。提示小腦NCAM表達(dá)和大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力具有一定關(guān)聯(lián)。

3 討論

在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中，睪酮常作為監(jiān)測(cè)人體機(jī)能和負(fù)荷量的一項(xiàng)重要指標(biāo)［15-16］。相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)［17］，大鼠進(jìn)行3周的中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練（跑速為20 m/min，1 h/d）后，其血睪酮含量上升明顯。另外，也有研究證實(shí)，持續(xù)5周過(guò)度游泳訓(xùn)練（負(fù)自身體重3.5%，90 min/d）的大鼠，盡管經(jīng)過(guò)24 h的充分休息，但其血睪酮含量依然顯著下降［18］。由此可知：血睪酮含量可作為大鼠運(yùn)動(dòng)建模效果的一個(gè)驗(yàn)證指標(biāo)。本研究采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠血睪酮含量變化，空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組和高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠自然喂養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠血睪酮含量顯著低于正常組，可見(jiàn)大鼠8周的高度負(fù)荷訓(xùn)練降低了其血睪酮含量，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與預(yù)想的運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)果相吻合，8周的高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)建?？煽?；中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠經(jīng)過(guò)24 h的休息，理論上其機(jī)體得以恢復(fù)，與正常組相比，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠血睪酮值出現(xiàn)明顯升高，可見(jiàn)中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠建模理想。

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力會(huì)受到運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量多寡的影響，對(duì)大鼠進(jìn)行8周的適量強(qiáng)度訓(xùn)練可提高低氧暴露大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［19］，而12月齡老年雄性大鼠經(jīng)過(guò)8周大負(fù)荷訓(xùn)練后，其認(rèn)知能力出現(xiàn)明顯下降［20］。為探究運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，我們對(duì)大鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)建模，并利用水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。結(jié)果顯示，與正常組相比，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠在第1 d的定位航行過(guò)程中耗時(shí)較短，平均逃避潛伏期顯著降低，表現(xiàn)出更加優(yōu)秀的空間學(xué)習(xí)能力，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［19］。有趣的是，雖然高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠第1 d平均逃避潛伏期較中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組升高明顯，但和正常組相比未出現(xiàn)明顯升高，高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)沒(méi)有明顯降低大鼠空間學(xué)習(xí)能力。從第2 d開(kāi)始，3組大鼠的潛伏耗時(shí)互相比較，無(wú)明顯差異，但和第1 d相比，3組大鼠平均潛伏用時(shí)均下降明顯，這種現(xiàn)象一直持續(xù)到第3 d；從第4 d起，3組大鼠耗時(shí)趨于穩(wěn)定，定位導(dǎo)航能力和前1 d比較，相差不大?？梢?jiàn)，在Morris水迷宮中，定位航行練習(xí)可使大鼠空間學(xué)習(xí)能力得以提高。中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中平均穿越平臺(tái)的次數(shù)比正常組明顯提高，說(shuō)明其空間記憶能力表現(xiàn)優(yōu)異；高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組大鼠平均穿越原平臺(tái)所處位置的次數(shù)較正常組明顯降低，證明了高度負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致空間記憶能力下降。

本課題組證明運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量的差異確實(shí)會(huì)對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力產(chǎn)生不同的影響。然而運(yùn)動(dòng)調(diào)控大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力是通過(guò)哪個(gè)腦區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)的？這一具體調(diào)控途徑又是什么呢？研究發(fā)現(xiàn)，空間學(xué)習(xí)和記憶能力除了受海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)支配外［2］，還受到小腦的調(diào)控［4］。

Colombel等［21］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠小腦半球?qū)嵭星谐g(shù)后，大鼠在Morris水迷宮中空間學(xué)習(xí)能力明顯受損；Tuma等［22］證實(shí)，在Morris水迷宮中，Lurcher小鼠和小腦蒲肯野細(xì)胞變異小鼠尋找平臺(tái)所用的逃避潛伏期更長(zhǎng)；同樣有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明，小腦蒲肯野細(xì)胞受損（L7-PP2B轉(zhuǎn)基因小鼠）可以導(dǎo)致空間導(dǎo)航和定位能力障礙［5］，這些實(shí)驗(yàn)表明小腦在空間學(xué)習(xí)與記憶過(guò)程中是十分重要的。為了進(jìn)一步探究，本文試圖引入一種糖蛋白——NCAM。NCAM作為免疫球蛋白超家族中一種細(xì)胞表面大分子，在軸突導(dǎo)向發(fā)育中起著重要的作用，它對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸的可塑性和學(xué)習(xí)記憶的形成也產(chǎn)生重要的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在亞長(zhǎng)期應(yīng)激刺激下，NCAM基因缺陷小鼠會(huì)產(chǎn)生一種壓抑性的行為，懸尾實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)移動(dòng)不靈活現(xiàn)象，Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損［7］。相反，7周中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后，大鼠在水迷宮中逃避潛伏耗時(shí)顯著縮短，并且其海馬NCAM表達(dá)得到顯著提高，大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力也得到改善［12］。另外，對(duì)腦部衰老大鼠加以有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)該手段可改善大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力并提高其NCAM表達(dá)［23］。NCAM的表達(dá)因N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體活化而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，在神經(jīng)元突觸傳遞過(guò)程中，NCAM180與膜收縮蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生聯(lián)系，并在嗜同性的相互作用下，大量的NCAM分子從突觸外位點(diǎn)彌散到突觸后膜，促進(jìn)NCAM在突觸過(guò)程中集聚。在長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的誘導(dǎo)下，NCAM（特別是NCAM180）在突觸后膜上表達(dá)升高［7，24］。原位雜交和免疫熒光結(jié)果表明，NCAM在小腦蒲肯野細(xì)胞中有表達(dá)，并且NCAM的表達(dá)與軸突的生長(zhǎng)有關(guān)，尤其在突觸穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出重要作用［25］。由于學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生的機(jī)制是突觸可塑性，而NCAM表達(dá)與突觸可塑性密切相關(guān)，綜合上述文獻(xiàn)研究，我們推斷游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能和NCAM在小腦內(nèi)的表達(dá)量有關(guān)。為了驗(yàn)證猜想，我們進(jìn)行了Western Blot和real time RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，適宜強(qiáng)度的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，小腦NCAM表達(dá)量會(huì)明顯升高，在中等負(fù)荷強(qiáng)度基礎(chǔ)上，隨著負(fù)荷量增大和游泳時(shí)間的延長(zhǎng)，小腦NCAM表達(dá)量未出現(xiàn)降低。采用偏相關(guān)分析，進(jìn)一步求證空間學(xué)習(xí)記憶能力和大鼠小腦中NCAM表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中等負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)可通過(guò)調(diào)高小腦NCAM表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的改善；高度負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)后，大鼠空間記憶能力出現(xiàn)減弱，但空間學(xué)習(xí)能力未明顯降低，這和高度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)組小腦NCAM的表達(dá)有關(guān)，揭示長(zhǎng)期高度負(fù)荷游泳訓(xùn)練后，大鼠小腦在學(xué)習(xí)引起的突觸網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重塑中出現(xiàn)某種代償，可能的機(jī)制是小腦NCAM參與修復(fù)高度負(fù)荷帶來(lái)的神經(jīng)損傷［26］。

在行為學(xué)習(xí)條件下，突觸的結(jié)構(gòu)可塑性表現(xiàn)為樹突棘更新速度加快、數(shù)目增多、細(xì)小的樹突棘在較大的樹突棘周圍形成環(huán)狀簇，樹突棘的形態(tài)會(huì)變得大而穩(wěn)定［6］。另外，從突觸的功能可塑性表現(xiàn)形式看，其生理學(xué)機(jī)制是LTP和長(zhǎng)時(shí)程抑制（lon-term depression，LTD），它們分別負(fù)責(zé)突觸的強(qiáng)化和弱化［27］，而且已有證據(jù)表明，在平行纖維和蒲肯野細(xì)胞突觸之間的長(zhǎng)時(shí)程抑制LTD是小腦運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)的神經(jīng)聯(lián)系［28］。那么在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后的大鼠，其小腦神經(jīng)元的樹突棘在數(shù)量和形態(tài)上會(huì)發(fā)生怎樣的變化呢？大鼠在進(jìn)行空間學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)時(shí)，小腦平行纖維到蒲肯野細(xì)胞之間的突觸功能可塑性如何？NCAM表達(dá)量的增減會(huì)不會(huì)影響小腦電生理變化呢？這些問(wèn)題有待進(jìn)一步追蹤并研究。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期適宜強(qiáng)度的游泳運(yùn)動(dòng)可以改善學(xué)習(xí)和記憶能力，其可能的機(jī)制是因?yàn)樾∧XNCAM表達(dá)量的調(diào)高。以適宜強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)為基礎(chǔ)，在運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增大以及運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)后，空間記憶能力表現(xiàn)衰弱，而小腦NCAM表達(dá)量和空間學(xué)習(xí)能力并未受到影響。