周瑞紅，彭永東，李祥龍

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 河北省特色動(dòng)物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島，066600)

赤狐毛皮經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，能給養(yǎng)狐業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益。然而，作為被保護(hù)的動(dòng)物之一，赤狐數(shù)量在不斷減少，其產(chǎn)仔數(shù)少是造成這種現(xiàn)象的主要原因之一，且狐貍的產(chǎn)仔數(shù)遺傳力低，采用常規(guī)育種方法很難在短時(shí)間內(nèi)取得較大進(jìn)展。另外，赤狐是季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，在每年的12月至2月發(fā)情。雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)是哺乳動(dòng)物雌激素受體的兩種亞型之一[1,2]。ESR1基因是一種核酸受體，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，參與雌性動(dòng)物性腺基因的表達(dá)與調(diào)控，且能影響胚胎發(fā)育和系統(tǒng)進(jìn)化，最終能夠影響動(dòng)物的繁殖表現(xiàn)[3,4]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因不僅可以調(diào)節(jié)性腺生長和分化，且能在機(jī)體能量代謝方面發(fā)揮重要作用[5,6]，可以影響動(dòng)物的繁殖性能。自雌激素受體的氨基酸序列公布后，對ESR1基因的研究也取得了較大進(jìn)展[7]。王宵燕等[8]利用ESR1基因上的PvuⅡ酶切位點(diǎn)作為蘇姜豬繁殖相關(guān)性狀遺傳標(biāo)記可以提高產(chǎn)仔數(shù)。有試驗(yàn)結(jié)果表明，綿羊ESR1基因主要位于細(xì)胞核中，并且參與機(jī)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[9]，也有試驗(yàn)以大白母豬進(jìn)行分析，表明B基因較A基因而言是優(yōu)勢基因，可以應(yīng)用于優(yōu)化繁殖性能[10]。綜合分析表明，ESR1基因?qū)?dòng)物育種具有一定應(yīng)用前景。因此，對ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行研究以便為今后的育種工作提供理論依據(jù)。

近年來，ESR1基因在家畜繁殖性能的研究和利用方面已經(jīng)成為熱點(diǎn)，前人的研究為其生物信息學(xué)分析提供了有價(jià)值的理論依據(jù)和研究意義。但國內(nèi)ESR1基因的研究集中在豬和綿羊，未見狐貍ESR1基因相關(guān)研究。為此，筆者利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)序列，并將其構(gòu)建至雙熒光素酶報(bào)告基因載體，通過在線軟件對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行深入分析，以期擴(kuò)充已有數(shù)據(jù)庫，為探究ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)所用赤狐來自河北省昌黎縣金島育種場，取肌肉組織-20 ℃保存，用于DNA提取。

試驗(yàn)用到的pMDTM18-T Vector Cloning Kit，T4-DNA Ligase，限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ以及DNA Marker購自Takara寶生物工程有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于博邁德生物技術(shù)有限公司；2×Es Taq MasterMix(Dye)購于康為世紀(jì)生物有限公司；DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司(美國)；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。引物合成和測序由北京六合華大基因公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成由于基因的啟動(dòng)子區(qū)域通常在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.0～2.0 kb，故本次研究選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約1.8 kb為候選啟動(dòng)子區(qū)。參考NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中GenBank數(shù)據(jù)庫公布的赤狐ESR1基因序列(登錄號：XM_025998015.1)，以5’ UTR上游序列約1 800 bp及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游78 bp為模板，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，利用DNASTAR7.1軟件進(jìn)行限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析，上游引物和下游引物分別引入MluⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)及其對應(yīng)的保護(hù)堿基。上游引物為：5’-CGACGCGTGCTGTTCATAGTCCAGGGTT-3’，下游引物為：5’- CCCTCGAGGCTCGCATGTGCGTGTAG-3’。引物由北京六合華大基因有限公司完成。

1.2.2赤狐ESR1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)生物信息學(xué)分析利用在線預(yù)測軟件Neural Network Promoter Predition，Promoter 2.0，TSSW和TSSG預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)；通過在線預(yù)測軟件MethPrimer預(yù)測CpG島；通過在線預(yù)測軟件Nsite，AliBaba 2.1，Cister和JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測核心啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在線預(yù)測軟件網(wǎng)址見表1。

表1 分子生物學(xué)及數(shù)據(jù)分析軟件

1.2.3赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)PCR擴(kuò)增以赤狐基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為40 μL：20 μL PrimeSTAR Max DNA Premix(2×)，14 μL ddH2O，2 μL DNA模板，上下游引物各2 μL(引物濃度10 μmol/L)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；經(jīng)94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，12 ℃保存。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4赤狐ESR1基因候選啟動(dòng)子區(qū)雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用回收試劑盒回收目的片段，回收得到的擴(kuò)增片段連接至pMDTM18-T載體；提質(zhì)粒后連同雙熒光素酶載體pGL3-Basic一起分別用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切(37 ℃, 2～3 h)，雙酶切反應(yīng)體系為20 μL：2 μL Green Buffer(10×), 2 μL 質(zhì)粒，14 μL ddH2O,MluⅠ和XhoⅠ各1 μL 。利用T4-DNA Ligase將雙酶切后的目的片段與pGL3-Basic載體16 ℃過夜連接，連接體系為20 μL：2 μL T4 DNA Ligase，2 μL T4 DNA Ligase Buffer(10×)， 2 μL 酶切后的pGL3-Basic質(zhì)粒，8 μL目的片段，6 μL ddH2O。通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；后進(jìn)行涂板培養(yǎng)，挑取陽性單克隆菌落進(jìn)行鑒定、測序，測序成功后提質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 結(jié)果與分析

3.1 赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)序列的擴(kuò)增及載體構(gòu)建

通過PCR擴(kuò)增出赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)約1 880 bp的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果與預(yù)期片段大小一致(圖1)，經(jīng)pMDTM18-T中間載體后構(gòu)建至表達(dá)載體pGL3-Basic上，經(jīng)菌液PCR、雙酶切及測序鑒定后，目的片段大小一致且序列正確，表明重組克隆載體pGL3-Basic-ESR1構(gòu)建成功(圖2)，該重組質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)試驗(yàn)。

1：目的片段；M：D2000 DNA Marker圖1 PCR電泳檢測結(jié)果

1：目的片段；M：D2000 Plus DNA Marker圖2 重組載體雙酶切檢測結(jié)果

3.2 赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)序列生物信息學(xué)分析

運(yùn)用在線軟件對測序得到的結(jié)果進(jìn)行序列分析，GC含量占49.89%，AT含量占50.11%。用在線軟件Promoter 2.0預(yù)測出2個(gè)啟動(dòng)子臨界位置，分別為-1 602 bp(得分0.583)和-502 bp(得分0.671)；TSSW程序預(yù)測啟動(dòng)子位置在-1 702 bp(得分1.04)；TSSG預(yù)測啟動(dòng)子位置在-1 548 bp(得分6.81)。在線預(yù)測軟件Neural Network Promoter Predition分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)核心啟動(dòng)子(表2)。

表2 赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)Neural Network Promoter Predition程序預(yù)測結(jié)果

3.3 赤狐ESR1基因CpG島及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

所獲得的赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作用元件，如AP-1，SRF，GATA-1，c-Jun，Oct-1，SP1，NF-1和cEBP等識別位點(diǎn)，其中Sp1家族結(jié)合位點(diǎn)、NF-1和cEBP的結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)頻率較高且在多個(gè)預(yù)測軟件中出現(xiàn)。綜合多個(gè)軟件對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測分析，單個(gè)軟件預(yù)測結(jié)果不做考慮，結(jié)果見表3。

表3 赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

一般認(rèn)為，CpG島大于100 bp，且GC含量大于50%，使用MethPrimer軟件預(yù)測分析顯示ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)CpG島(圖3)，長度為148 bp，位于-1 749～-1 602 bp。

圖3 赤狐ESR1基因CpG島預(yù)測結(jié)果

4 結(jié)論與討論

ESR1基因通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白控制雌激素基因的轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)而對生殖發(fā)育等功能產(chǎn)生影響[11]。已經(jīng)有研究證實(shí)ESR1基因在動(dòng)物繁殖中發(fā)揮著重要的作用[12]，因此在今后的育種工作可以利用相關(guān)的研究成果以提高產(chǎn)仔數(shù)，為養(yǎng)狐業(yè)提供經(jīng)濟(jì)效益?；虮磉_(dá)調(diào)控中最重要的就是轉(zhuǎn)錄的起始，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實(shí)質(zhì)是通過上游調(diào)控序列與啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)[13]，基因啟動(dòng)子活性區(qū)域研究對揭示基因功能具有重要的意義[14]。然而，赤狐ESR1基因啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控機(jī)理等尚未報(bào)道。因此，本次研究對赤狐ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)的序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，有助于闡明其功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步揭示赤狐ESR1基因作用機(jī)理和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)鑒定提供參考依據(jù)。

本次研究成功克隆了ESR1基因啟動(dòng)區(qū)序列，并將其成功構(gòu)建至雙熒光素酶報(bào)告基因載體。有研究發(fā)現(xiàn)，若克隆片段中只含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游區(qū)域可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性，而克隆片段中包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、ATG或部分CDS區(qū)序列會(huì)很大的提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的陽性率[15]。故本次研究克隆的片段中包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游78 bp序列，符合上述要求，實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出的ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)序列與預(yù)測基本一致?；虮磉_(dá)是靠轉(zhuǎn)錄因子來進(jìn)行調(diào)控的，不同的轉(zhuǎn)錄因子有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，靠與特定的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而改變mRNA的轉(zhuǎn)錄水平[13]。Sp1是哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)錄活化的必需因子，可通過識別基因啟動(dòng)子上富含GC序列的位點(diǎn)發(fā)揮作用，其結(jié)合位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)構(gòu)域中分布非常廣泛，且在哺乳動(dòng)物大量的基因表達(dá)和細(xì)胞生物學(xué)的調(diào)控進(jìn)程中發(fā)揮作用[16～19]。研究已證明，Sp1對于小鼠胚胎發(fā)育表達(dá)的第一個(gè)基因HSP70.1的轉(zhuǎn)錄來說是必需的[20]；除此之外，在基因的表達(dá)調(diào)控中，Sp1具有協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄的功能，即轉(zhuǎn)錄水平在有兩個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)存在時(shí)會(huì)大大提高[21]。NF-1轉(zhuǎn)錄因子是重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，通過與CAAT box結(jié)合從而影響基因的表達(dá)，目前已有研究表明，在NF-1與以RNA聚合酶Ⅱ?yàn)檗D(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成有緊密聯(lián)系[22]，這說明NF-1可能在ESR1基因的表達(dá)中發(fā)揮作用。

本次研究運(yùn)用多個(gè)生物信息學(xué)軟件對赤狐雌激素受體ESR1基因候選啟動(dòng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，增加了預(yù)測結(jié)果的可靠性，為后續(xù)的ESR1基因的研究奠定理論基礎(chǔ)，后續(xù)還需要對啟動(dòng)子核心區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用等進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Transient Transfection)試驗(yàn)驗(yàn)證，對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)還可進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)技術(shù)、凝膠阻滯分析(Electrophretic Mobility Shift Assay, EMSA)試驗(yàn)和DNA足紋分析(DNase footprinting)等驗(yàn)證其具體作用及功能。