袁 歡 彭莉莎 孫夢(mèng)瑤 曹清明，2 龍奇志

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

菱角是菱角科菱角屬一年生浮葉水生植物，主要品種有兩種，即四角菱(TrapaquadrispinosaRoxb.)和二角菱(TrapabispinosaRoxb.)[1]，常分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)的淡水濕地、湖泊、池塘、河流緩流河段[2-3]。菱角的果肉可以食用，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。但菱角殼往往作為廢棄物丟棄，不僅造成植物資源的浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。

菱角殼提取物具有多種生物活性，包括抗氧化[4]、降血糖[5-6]、保護(hù)肝臟細(xì)胞[7-8]、抗癌[9]77-78[10-12]等作用。菱角殼的功能作用主要是由于菱角殼中富含酚酸[13]、黃酮類[6, 14]、多糖[15]、皂苷[9]68、甾體[16]和生物堿[1, 17-20]等活性化合物。Malviya等[21]研究了菱角殼水提物抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中酚類、類黃酮和單寧化合物含量分別為63.81 mg GAE/g·DW，21.34 mg RE/g·DW和17.11 mg TE/g ·DW。呂喆等[22]采用微波萃取法從野生菱角皮和菱角仁中提取到甾醇類化合物，并用高效液相色譜法鑒定其為豆甾醇和β-谷甾醇。Kim等[7]測(cè)定了菱角殼水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮含量分別為(21.00±1.32)，(45.00±1.03) mg CE/g。鞣質(zhì)是菱角殼中的主要酚類化合物。Huang等[6]從歐菱中分離得到?jīng)]食子酸和6個(gè)可水解單寧。林秋生[9]72-78從無(wú)角菱殼中分離得到?jīng)]食子酸及其二聚體。周光雄等[10]用85%乙醇提取，從菱角殼中分離得到兩個(gè)主要成分：1,2,6-三沒食子酰-沒食子酰葡萄糖和1,2,3,6-四沒食子酰-沒食子酰葡萄糖，進(jìn)一步研究表明，這兩種鞣酸類物質(zhì)具有抗腫瘤活性。符少蓮等[23]運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)菱角殼乙酸乙酯萃取部分中的鞣質(zhì)類化合物進(jìn)行了測(cè)定，1,2,6-三沒食子酰-β-D-葡萄糖和1,2,4,6-四沒食子酰-β-D-葡萄糖含量分別為85.7，244.0 mg/g。

大孔樹脂因其具有多孔性結(jié)構(gòu)，以及表面電性或氫鍵而具有吸附性。利用其對(duì)不同成分的選擇性吸附和篩選作用，能夠分離、提純某一種或某一類有機(jī)化合物[24-25]。天然產(chǎn)物化合物制備的前處理時(shí)，通常會(huì)利用樹脂去除大部分極性和離子物質(zhì)[26-27]，如糖和酸；食品工業(yè)中，為了減少有機(jī)溶劑的使用和設(shè)備能耗，提高分離效率，也需要用到大孔樹脂分離。Pradal等[28]用5種食品級(jí)高分子樹脂XAD 2、XAD 4、XAD 7、XAD 1180和XAD 16從菊苣渣中回收多酚，在優(yōu)化的工藝條件下，多酚總回收率提高到50%；白萬(wàn)明等[29]用AB-8大孔樹脂對(duì)橄欖油加工廢液中的橄欖多酚進(jìn)行富集，其多酚能富集到原來(lái)的7.93倍，多酚純度達(dá)到56.44%。呂寒等[30]用弱極性樹脂LS-300B11對(duì)四角菱50%乙醇提取物進(jìn)行純化，多酚的最終濃度為91.7%。二角菱與四角菱的多酚種類[31]和數(shù)量[32]差別很大，研究擬對(duì)95%乙醇提取液的乙酸乙酯萃取液進(jìn)行純化，從7種大孔樹脂中篩選出對(duì)菱角殼中多酚吸附性能最好的樹脂，以期為菱角殼的利用及相關(guān)保健食品的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二角菱殼：湖南益陽(yáng)，曬干，粉碎后于-4 ℃下保存；

無(wú)水乙醇：AR級(jí)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氫氧化鈉：AR級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

鹽酸：AR級(jí)，株洲市星空化玻有限責(zé)任公司；

碳酸鈉：AR級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

福林試劑：AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大孔樹脂：D101、AB-8、X-5、D3520、DA201、D1300、NKA-2型，0.30～1.25 mm，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(jì)：721型，上海菁華科技儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-5205型，上海亞榮生化儀器廠；

低溫循環(huán)真空泵：DLSB-FZ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

電子天平：FA1004N型，上海菁海有限公司；

磁力加熱鍋：ZNCL-DLS190×90型，上海弘懿儀器設(shè)備有限公司；

髙速萬(wàn)能粉碎機(jī)：LD-Y300A型，上海頂帥電器有限公司；

空氣浴振蕩器：HZQ-C型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

恒溫磁力攪拌水浴鍋：HCJ-60型，常州市中貝儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：Scientz-10N型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 二角菱殼樣品的制備 取二角菱殼粉末1 kg，按固液比(m殼粉∶V乙醇)為1∶10 (g/mL)用95%乙醇提取40 min，溫度為50 ℃，將殘?jiān)^(guò)濾，濾液減壓濃縮。濃縮液按m濃縮液∶V水=1∶13 (g/mL)用純水稀釋，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，濃縮，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇浸膏。乙酸乙酯浸膏凍干，得到凍干樣品固形物29.4 g，按固形物配制成100 mg/mL的樣液備用。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取25 mg沒食子酸，溶于無(wú)水乙醇，定容到25 mL(1 mg/mL)。配制成0.02 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

分別吸取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的0.02 mg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，用水補(bǔ)至2 mL，各加入福林試劑0.5 mL，搖動(dòng)混合后靜置3 min，加入10%的Na2CO3溶液1 mL，使總體積為3.5 mL。經(jīng)70 ℃水浴加熱10 min后，于725 nm下測(cè)定吸光度值。以沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為x軸，吸光度值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品總多酚含量的測(cè)定 大孔樹脂洗脫過(guò)程中樣品需要進(jìn)行總多酚的測(cè)定。準(zhǔn)確移取適量待測(cè)樣液于10 mL 具塞試管中，用水補(bǔ)至2 mL，加入0.5 mL福林酚試劑，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，在725 nm下測(cè)得吸光度，代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可得到大孔樹脂洗脫前、后樣品中的總多酚含量(表示為mg GAE/g)。

1.3.4 大孔樹脂型號(hào)的篩選

(1) 大孔樹脂的預(yù)處理：大孔樹脂使用前需經(jīng)過(guò)預(yù)處理以將有毒有機(jī)聚合物去除。參照文獻(xiàn)[33]，先用蒸餾水沖洗樹脂，再以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇將樹脂浸泡12 h，然后用蒸餾水沖洗至無(wú)乙醇味；分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的氫氧化鈉和體積分?jǐn)?shù)5%的鹽酸依次浸泡3 h，每次浸泡后用蒸餾水洗樹脂至中性，備用。

(2) 7種大孔樹脂的吸附性能比較：準(zhǔn)確稱取7種不同型號(hào)大孔樹脂D101、AB-8、X-5、D3520、DA201、D1300、NKA-2各2 g于錐形瓶中(每組3份平行)，加入20 mL固形物質(zhì)量濃度為4 mg/mL的乙酸乙酯部位樣品液，于25 ℃、120 r/min的搖床上振搖使其充分吸附12 h，吸取上清液，測(cè)定總酚含量，按照式(1)和式(2)計(jì)算7種大孔樹脂的吸附量、吸附率。將上清液倒入試管中，用少量蒸餾水清洗樹脂，過(guò)濾，吸干樹脂表面水分后，將樹脂移至錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液20 mL，于相同條件下振蕩12 h，取適量上清液，測(cè)定吸光度值，用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總多酚含量。按照式(3)和式(4)計(jì)算大孔樹脂的解吸量和解吸率。

QA=(C0-C1)×V1/m，

(1)

RA=[(C0-C1)/C0]×100%，

(2)

QD=C2×V2/m，

(3)

RD=[C2/(C0-C1)]×100%，

(4)

式中：

QA——吸附量，mg GAE/g；

RA——吸附率，%；

QD——解吸量，mg GAE/g；

RD——解吸率，%；

C0——二角菱殼乙酸乙酯萃取段的初始多酚含量，mg GAE/mL；

C1——吸附后溶液中多酚含量，mg GAE/mL；

C2——解吸后乙醇洗脫液的多酚含量，mg GAE/mL；

V1——使用的樣品液體積，mL；

V2——洗脫溶劑體積，mL；

m——樹脂吸去水分的質(zhì)量，g。

1.3.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

(1) 上樣液固形物濃度對(duì)大孔樹脂吸附性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂2 g放入100 mL 錐形瓶中，取乙酸乙酯部位樣品液20 mL，固形物含量分別為2，3，4，5，6 mg/mL，于搖床中(25 ℃、120 r/min)振蕩進(jìn)行吸附試驗(yàn)，12 h后取上清液，測(cè)定樣品中總多酚含量，考察大孔樹脂對(duì)多酚的吸附量。

(2) 洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂解吸性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂2 g放入100 mL錐形瓶中，取固形物濃度為5 mg/mL的乙酸乙酯部位樣液20 mL，于搖床中(25 ℃、120 r/min)振蕩進(jìn)行吸附試驗(yàn)，12 h后除去上清液，大孔樹脂使用蒸餾水清洗至表面無(wú)殘留，分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液，于搖床中(25 ℃、120 r/min)振蕩進(jìn)行解吸試驗(yàn)，12 h后取上清液，測(cè)定樣品中總多酚的質(zhì)量濃度，考察大孔樹脂對(duì)多酚的解吸量。

1.3.6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

(1) 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂10 g裝入玻璃層析柱(1.8 cm×20 cm)中，取固形物濃度為5 mg/mL乙酸乙酯部位35 mL，上樣流速1，2，3，4，5 mL/min進(jìn)行吸附試驗(yàn)，收集流出液，測(cè)定流出液的多酚含量，考察上樣流速對(duì)吸附率的影響。

(2) 洗脫流速對(duì)大孔樹脂解吸性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂10 g裝入玻璃層析柱中，取固形物濃度為5 mg/mL的乙酸乙酯部位35 mL，以流速1 mL/min上樣，進(jìn)行吸附試驗(yàn)；用70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))5 BV(柱體積)，以洗脫流速分別為1，2，3，4，5 mL/min 進(jìn)行洗脫，收集流出液，測(cè)定流出液的總酚含量，考察洗脫流速對(duì)解吸率的影響。

(3) 洗脫體積對(duì)大孔樹脂解吸性能的影響：分別稱取5份預(yù)處理好的D101大孔樹脂10 g裝入玻璃層析柱中，取固形物濃度為5 mg/mL的乙酸乙酯部位35 mL，以1 mL/min 流速上樣，進(jìn)行吸附試驗(yàn)；70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))以4 mL/min，分別用3，4，5，6，7 BV進(jìn)行洗脫，收集流出液。測(cè)定流出液的多酚含量，考察洗脫溶劑體積對(duì)解吸率的影響。

1.3.7 最佳工藝的驗(yàn)證與放大 采用上述試驗(yàn)優(yōu)化的D101大孔樹脂的吸附—解吸的最佳工藝條件，對(duì)二角菱乙酸乙酯萃取液進(jìn)行吸附—解吸的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，收集流出液，濃縮，凍干，得到純化的樣品，測(cè)定樣品總多酚含量，以多酚含量考察樣品的純度。采用與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)相同的條件，將D101樹脂總量擴(kuò)大30倍，裝于4.0 cm×50 cm 的層析柱中，上樣量為1 050 mL，收集流出液，濃縮，凍干，得到放大試驗(yàn)的總多酚含量，考察樣品的純度。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)測(cè)定重復(fù)處理3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件處理，其中P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=124.05x-0.003 4，R2=0.999 1，在0.001 09～0.005 63 mg/mL范圍內(nèi)吸光度值與沒食子酸質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。

2.2 樣品總多酚含量

按照1.3.3對(duì)樣品中總多酚含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)計(jì)算，凍干樣品(固形物)中總酚含量為478 mg GAE/g。配制的100 mg/mL 的固形物樣液中總酚含量為47.8 mg GAE/mL。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 大孔樹脂型號(hào)的篩選

表1為7種大孔樹脂對(duì)二角菱殼乙酸乙酯部位中多酚靜態(tài)吸附及解吸情況，其中D101、D1300、AB-8、D3520型大孔樹脂對(duì)多酚吸附能力較強(qiáng)，DA-201、D101、D1300大孔樹脂的解吸性能較強(qiáng)，但DA-201大孔樹脂的吸附性能較低，D1300大孔樹脂的解吸率較低，綜合考慮，選用D101大孔樹脂作為二角菱殼乙酸乙酯部位多酚純化的材料。

表1 7種大孔樹脂對(duì)二角菱殼乙酸乙酯部位中多酚靜態(tài)吸附及解吸?

2.4 D101大孔樹脂靜態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

2.4.1 上樣液固形物質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹脂吸附性能的影響 由圖2可知，隨著上樣液固形物質(zhì)量濃度的增加，D101型大孔樹脂對(duì)多酚的吸附量先增加后減小，以20 mL 上樣，當(dāng)上樣液固形物質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)吸附量最大(22.19 mg GAE/g)。原因可能是上樣液固形物質(zhì)量濃度>5 mg/mL時(shí)，樣液中的其他物質(zhì)增多，會(huì)與多酚物質(zhì)爭(zhēng)奪D101大孔樹脂的活性位點(diǎn)[34]，造成多酚的吸附量下降；上樣固形物質(zhì)量濃度<5 mg/mL時(shí)，樣品質(zhì)量濃度被稀釋，多酚含量減少，造成吸附量降低。因此最佳的上樣固形物質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

2.4.2 洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂解吸性能的影響 由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，動(dòng)態(tài)解吸量呈先增加后降低的趨勢(shì)；以20 mL上樣，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，動(dòng)態(tài)解吸量最高(22.53 mg GAE/g)。其原因可能為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇更有利于二角菱殼中總多酚的溶解，增加乙醇體積分?jǐn)?shù)可能會(huì)影響二角菱殼乙酸乙酯部位中總多酚和大孔樹脂之間的相互作用[35]。因此選用洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖2 上樣濃度對(duì)D101大孔樹脂吸附性能的影響

2.5 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附—解吸條件優(yōu)化

2.5.1 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附性能的影響 由圖4可知，隨著上樣流速的增大，動(dòng)態(tài)吸附率逐漸下降；當(dāng)上樣液流速為1 mL/min時(shí)，大孔樹脂能夠充分吸附樣品，動(dòng)態(tài)吸附率高達(dá)98.65%。這可能是因?yàn)樯蠘右毫魉龠^(guò)快導(dǎo)致上樣液在層析柱中停留的時(shí)間較短，不能與大孔樹脂充分地接觸，使得吸附效果不理想[34]。

圖3 洗脫溶劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)對(duì)D101大孔樹脂解吸性能的影響

圖4 上樣流速對(duì)D101大孔樹脂吸附性能的影響

2.5.2 洗脫流速對(duì)大孔樹脂解吸性能的影響 由圖5可知，隨著洗脫流速的增加，動(dòng)態(tài)解吸率呈先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)洗脫流速為4 mL/min時(shí)，動(dòng)態(tài)解吸率最高(69.00%)。超過(guò)4 mL/min后解吸率降低，可能是因?yàn)榻馕軇┩ㄟ^(guò)層析柱速度過(guò)快，使得解吸溶劑不能與樹脂充分接觸，影響了解吸液對(duì)樣品中總多酚的溶解。因此，最佳洗脫流速為4 mL/min。

2.5.3 洗脫溶劑體積對(duì)大孔樹脂解吸性能的影響 由圖6 可知，當(dāng)洗脫溶劑體積為5 BV(即60 mL)時(shí)，動(dòng)態(tài)解吸率最高(65.31%)。其原因可能是隨著洗脫溶劑體積的增加，二角菱殼中總多酚被充分洗脫，再增加洗脫溶劑的體積，解吸能力下降，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)增加生產(chǎn)成本[36]。因此，選擇洗脫溶劑體積為5 BV。

2.6 最佳工藝的驗(yàn)證與放大

采用優(yōu)化的試驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其條件為樣液固形物質(zhì)量濃度5 mg/mL，上樣流速1 mL/min，以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液為洗脫劑，用4 mL/min的洗脫流速，洗脫5 BV(柱體積)；將上樣量放大30倍，其他條件不變，進(jìn)行放大試驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和放大試驗(yàn)前后，多酚的純化結(jié)果見表2。該條件下多酚含量由478.14 mg GAE/g，純化到825.21 mg GAE/g，提高了1.73倍。放大試驗(yàn)條件下，純化效果相當(dāng)。

圖5 洗脫流速對(duì)D101大孔樹脂解吸性能的影響

圖6 洗脫溶劑體積對(duì)大孔樹脂解吸性能的影響

表2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和放大試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)選用成本相對(duì)較低的一些大孔樹脂來(lái)純化菱角多酚，通過(guò)比較研究，篩選出最優(yōu)的大孔樹脂為D101型大孔樹脂，對(duì)D101大孔樹脂純化二角菱乙酸乙酯萃取液中的總多酚條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳工藝條件下，多酚含量由478 mg GAE/g上升到825 mg GAE/g，提高了1.73倍，因此，D101大孔樹脂對(duì)二角菱殼乙酸乙酯萃取液中的總多酚有較好的純化效果。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉且效果好，具備推廣應(yīng)用潛力。