馬鵬飛 齊 碩 呂 艷 周 游 王周平

(1. 江南大學(xué)食品國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗生素，對革蘭氏陽性和陰性菌均有抑制作用，曾被廣泛地應(yīng)用于感染性疾病治療[1-3]。然而氯霉素對人體有很大的毒副作用，可抑制人體骨髓造血功能從而引起再生性障礙性貧血癥等[4-5]。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告，氯霉素禁止在食品和動物飼料中使用。由于氯霉素低廉的成本和優(yōu)異的抑菌效果，目前仍然有一些氯霉素在蜂蜜、牛奶和水產(chǎn)品中違法使用的報道。因此，為了保障公眾健康，需要建立一種準(zhǔn)確靈敏的氯霉素檢測方法。目前廣泛使用的氯霉素檢測方法有液相色譜—質(zhì)譜法[6]、酶聯(lián)免疫法[7]、超高效液相色譜法[8]等，但是這些方法需要專業(yè)和經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員，儀器價格昂貴且檢測耗時較長。近年來，科研人員報道了一些基于納米材料和核酸適配體的新型氯霉素檢測方法，包括電化學(xué)法[9]、熒光法[10]和比色法[11]等，為氯霉素的檢測提供了新思路。

適配體(Aptamer)是通過指數(shù)富集配體進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選得到，長度在10～100個核苷酸范圍內(nèi)的單鏈DNA或RNA。適配體能夠通過結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、氫鍵和疏水相互作用等與生物小分子、金屬離子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞以及細(xì)菌等高效的結(jié)合[12-14]。適配體與抗體相比，具有制備簡單，易于功能化修飾，穩(wěn)定性好的優(yōu)點[15-18]。適配體的這些優(yōu)點為研制應(yīng)用于食品安全檢測與控制中的傳感器提供了基礎(chǔ)。如趙旭等[19]研制了一種基于核酸適配體的鎘離子可視化檢測方法，檢測的線性范圍為0.1～5.0 ng/mL，檢測為0.5 ng/mL。許宙等[20]基于磁性納米材料，構(gòu)建了一種酶聯(lián)增敏適配體傳感器檢測雙酚A，檢測限低至0.5 pg/mL。

二氧化錳納米片(Manganese dioxide nanosheet，MnO2NS)是一種超薄的二維納米材料，具有優(yōu)良的熒光淬滅能力，在生物傳感，細(xì)胞成像和藥物輸送領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[21-23]，如Wang等[24]基于MnO2NS淬滅有機(jī)染料熒光原理，構(gòu)建了檢測microRNA的傳感平臺，檢測限為0.8 nmol/L。核酸外切酶I(Exonuclease I, Exo-I)能夠以3末端到5末端方向降解單鏈DNA，不依賴于特異的核苷酸序列，能夠有效地擴(kuò)增信號進(jìn)而實現(xiàn)對靶標(biāo)的檢測。

研究擬利用MnO2NS對核酸適配體的熒光淬滅能力，以及Exo-I的酶促靶標(biāo)循環(huán)放大信號作用，構(gòu)建一種靈敏的氯霉素?zé)晒鈾z測新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白(BSA)、醋酸錳、氯化鈉和氯化鉀等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

FAM標(biāo)記的氯霉素適配體(5’-FAM-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG)、核酸外切酶I(Exo-I，20 U/μL)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

氯霉素、四環(huán)素、土霉素、卡那霉素和甲砜霉素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

全黑96孔微孔板：美國康寧公司；

氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒：百奧森食品安全科技有限公司；

超純水：18.2 MΩ，由Millipore凈水系統(tǒng)制備。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀：BioTek SynergyH1型，美國BioTek 公司；

透射電鏡：JEM-2100型，日本電子株式會社；

原子力顯微鏡：Dimension ICON型，德國布魯克科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 MnO2NS的制備 二氧化錳的合成參照Han等[25]的方法并作改進(jìn)。取1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的BSA和1 mL質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的醋酸錳置于250 mL的燒杯中，并向燒杯中加入98 mL超純水至燒杯內(nèi)溶液總體積為100 mL；將燒杯置于磁力攪拌器上，常溫攪拌均勻；50 min后，向溶液中加入濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)到8.0；將溶液置于磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌6 h，得到淺黃色的溶液，溶液經(jīng)離心沉淀后，所得材料沉淀用超純水清洗兩次，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測體系的構(gòu)建 將適配體原液(1 μmol/L)在95 ℃ 加熱5 min后，置于室溫靜置30 min，使適配體形成穩(wěn)定的空間構(gòu)象。在1.5 mL的離心管中加入10 μL的適配體原液和10 μL的MnO2NS原液(1 mg/mL)，加入180 μL氯霉素結(jié)合緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，pH 7.4)使得溶液總體積為200 μL。為了使適配體完全被MnO2NS吸附，適配體與MnO2NS在室溫避光條件下，孵育30 min。將5 μL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品加入到離心管中，同時加入4 μL的Exo-I，37 ℃下避光孵育50 min。最后將100 μL反應(yīng)液體加入酶標(biāo)板中，置于酶標(biāo)儀中檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm。

1.2.3 MnO2NS質(zhì)量濃度的優(yōu)化 MnO2NS的質(zhì)量濃度與適配體是否被完全吸附有關(guān)，如果溶液中有游離的適配體，會造成檢測的熒光背景信號高，影響檢測性能。在50 nmol/L適配體濃度下，加入不同體積的MnO2NS，使其終質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mg/mL，測定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.4 適配體濃度的優(yōu)化 固定Exo-I的用量和酶切時間不變，在5 nmol/L氯霉素濃度下，加入不同濃度的適配體，使其終濃度分別為5，10，20，50，100，150，200 nmol/L，測定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Exo-I用量的優(yōu)化 固定適配體濃度，MnO2NS質(zhì)量濃度和酶切時間不變，在5 nmol/L氯霉素濃度下，加入不同體積的Exo-I，使其在檢測體系中的用量分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 U/μL，測定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.6 酶切時間的優(yōu)化 固定適配體濃度，MnO2NS質(zhì)量和Exo-I用量不變，在5 nmol/L氯霉素濃度下，酶切時間分別為10，30，50，70，90，110 min，測定熒光強(qiáng)度。

1.2.7 實際樣品檢測 從當(dāng)?shù)爻匈徺I合格的蜂蜜，用氯霉素適配體結(jié)合緩沖液稀釋20倍之后，用0.22 μm 濾膜過濾稀釋液體。將不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品加入濾液，用試驗構(gòu)建的檢測方法進(jìn)行檢測，計算實際樣品檢測加標(biāo)回收率，并與商用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

如圖1所示，熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記的氯霉素適配體首先被MnO2NS吸附，基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)，適配體標(biāo)記的熒光被淬滅。當(dāng)溶液中無氯霉素時，即使加入Exo-I，由于MnO2NS會阻礙酶切，Exo-I無法剪切被二氧化錳吸附的適配體，溶液無熒光恢復(fù)。當(dāng)溶液中存在氯霉素時，適配體特異性地與氯霉素結(jié)合后，從MnO2NS表面解離，溶液熒光恢復(fù)；在有Exo-I存在的條件下，Exo-I剪切溶液中與氯霉素結(jié)合而脫離MnO2NS的適配體。適配體由于被剪切，失去了結(jié)構(gòu)的完整性進(jìn)而無法與氯霉素結(jié)合，釋放出來的氯霉素會再次與被MnO2NS吸附的適配體結(jié)合，使適配體從MnO2NS表面解離，溶液進(jìn)一步恢復(fù)熒光，從而實現(xiàn)對氯霉素的檢測。

圖1 氯霉素檢測原理圖

2.2 二氧化錳納米片的表征

圖2為MnO2NS的表征圖。由圖2(a)可知，制備的MnO2NS呈薄片狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積；由圖2(b)和圖2(c)可知，制備的MnO2NS厚度大約為1.2 nm，是單層MnO2NS。

2.3 試驗條件優(yōu)化

2.3.1 MnO2NS質(zhì)量濃度的優(yōu)化 由圖3可知，隨著MnO2NS質(zhì)量濃度的增加，溶液的熒光值減小，當(dāng)MnO2NS 質(zhì)量濃度≥0.05 mg/mL時，溶液中適配體的熒光被完全淬滅，表明適配體完全被MnO2NS吸附，無游離的，因此選擇0.05 mg/mL為MnO2NS的最佳質(zhì)量濃度。

2.3.2 適配體濃度的優(yōu)化 由圖4可知，隨著適配體濃度的增加，溶液的熒光值增加，當(dāng)適配體的濃度≥50 nmol/L 時，溶液的熒光值基本達(dá)到飽和，說明此時適配體的量已經(jīng)達(dá)到飽和，同時為了節(jié)約適配體的使用量，增加檢測的經(jīng)濟(jì)性，選擇50 nmol/L為適配體的最佳濃度。

圖2 二氧化錳納米片表征圖

2.3.3 Exo-I用量的優(yōu)化 由圖5可知，隨著Exo-I用量的增加，更多的適配體從MnO2NS解離，溶液熒光強(qiáng)度增大，當(dāng)酶在檢測體系中的用量≥0.4 U/μL時，溶液熒光強(qiáng)度基本保持不變，說明體系中酶的用量達(dá)到飽和，選擇0.4 U/μL作為Exo-I的最佳用量。

圖3 二氧化錳納米片質(zhì)量濃度的優(yōu)化

2.3.4 酶切時間的優(yōu)化 由圖6可知，隨著酶切時間的增加，溶液熒光強(qiáng)度迅速增大，當(dāng)酶切時間≥40 min時，溶液的熒光值趨于平穩(wěn)，說明酶切達(dá)到飽和；若酶切不充分，體系熒光弱，將影響檢測性能；而酶切時間過長，將影響檢測效率，因此選擇50 min作為最佳酶切時間。

2.4 線性范圍與檢測限

在最佳的試驗條件下，利用構(gòu)建的檢測方法，對不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，由圖7可知，氯霉素的濃度為0.1～80.0 nmol/L時，氯霉素濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性，校正曲線方程為y=856lgx+1 459(R2=0.995)，檢出限為0.08 nmol/L(S/N=3)。

圖4 適配體濃度的優(yōu)化

圖5 核酸外切酶I用量的優(yōu)化

圖6 酶切時間的優(yōu)化

2.5 特異性

為了驗證檢測方法的特異性，在最優(yōu)試驗條件下，選擇甲砜霉素、四環(huán)素、土霉素、卡那霉素進(jìn)行分析檢測，濃度均為1 nmol/L。由圖8可知，氯霉素與其他抗生素的熒光強(qiáng)度差距明顯，表明該適配體傳感器具有良好的特異性。

2.6 實際樣品加標(biāo)回收試驗

為了驗證所構(gòu)建的適配體傳感器在實際樣品檢測中的準(zhǔn)確性，用蜂蜜樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，并將檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫法進(jìn)行對比，結(jié)果見表1。由表1可知，加標(biāo)試驗回收率為92%～99%，酶聯(lián)免疫法的回收率為91%～103%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確性，可用于實際樣品檢測。

圖7 熒光強(qiáng)度與氯霉素的線性關(guān)系

圖8 特異性分析

表1 氯霉素加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

研究構(gòu)建了一種基于MnO2NS和Exo-I酶切擴(kuò)增的方法檢測氯霉素，在最優(yōu)條件下，檢測限達(dá)0.08 nmol/L。檢測方法操作簡單，特異性好，靈敏度高，在實際樣品檢測中加標(biāo)回收率與商用酶聯(lián)免疫試劑盒保持一致，具有較強(qiáng)的實用性，但酶的活性會受到溫度的影響，后續(xù)研究可通過加入一定量的多糖等增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。