鄭歐陽，孫欽秀，劉書成，潘燕墨

(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院， 廣東 湛江， 524088)

哈爾濱風(fēng)干腸是哈爾濱獨具特色的風(fēng)干發(fā)酵肉制品，由于其獨特的風(fēng)味而深受消費者的喜愛。然而在風(fēng)干腸的發(fā)酵過程中，一些具有脫羧酶活性的微生物可將氨基酸脫羧進而生成生物胺，雖然少量生物胺對人及生物體的一些生物功能是有利的，然而人類一旦攝入過量的生物胺就會引起胺中毒[1]。因此，如何控制風(fēng)干腸發(fā)酵過程中生物胺產(chǎn)生的量是風(fēng)干腸安全生產(chǎn)的重要難題。肉制品加工中常用的香辛料含有的一些有效成分(如：揮發(fā)性油、有機酸等)不僅可以賦予肉制品特有的風(fēng)味和香氣，還可以抑制細菌繁殖[2]。國內(nèi)外很多學(xué)者證明了香辛料提取物具有一定的抑制微生物生長的作用。ZHANG等[3]研究發(fā)現(xiàn)向雞肉中添加迷迭香和丁香提取物可以有效抑制微生物的生長。EVRENDILEK[4]綜述了不同植物精油對常見致病菌的抑菌效果。因此，可以將香辛料提取物添加到發(fā)酵肉制品中，通過抑制一些生物胺陽性菌的生長從而抑制生物胺的積累。目前生物胺抑制作用研究大多集中在水產(chǎn)品和酒類產(chǎn)品中，且利用微生物法抑制較多，而在畜禽肉制品中利用香辛料提取物來抑制生物胺積累的研究目前還鮮見報道。

因此，本研究將肉桂、丁香和八角醇溶提取物以不同方式組合(肉桂&八角，肉桂&丁香，丁香&八角和肉桂&丁香&八角)復(fù)配后添加到哈爾濱風(fēng)干腸中，研究風(fēng)干腸發(fā)酵過程中2-苯乙胺、腐胺、酪胺色胺、尸胺和組胺含量的變化，同時，檢測了發(fā)酵過程中風(fēng)干腸微生物數(shù)量、理化品質(zhì)和感官品質(zhì)的變化，以期找到一種可以抑制風(fēng)干腸中生物胺積累并改善其感官品質(zhì)的發(fā)酵方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物胺標(biāo)品(2-苯乙胺鹽酸鹽、組胺二鹽酸鹽、尸胺、腐胺二鹽酸鹽、色胺和酪胺)，美國Sigma公司；乙腈，德國Merck公司；鹽酸、甲醇、高氯酸、辛烷磺酸鈉、乙醇、氫氧化鉀、鄰苯二甲醛、冰乙酸、β-巰基乙醇、無水乙酸鈉、硫代巴比妥酸、三氯甲烷、氫氧化鈉、三氯乙酸、亞硝酸鈉、葡萄糖，哈爾濱醫(yī)藥化工試劑廠。以上試劑除乙腈和甲醇為色譜純，其他均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 香辛料提取

每種香辛料的提取方法遵循陳璐等[5]的方法稍作修改，將市場上買來的3種香辛料放在風(fēng)干箱中，在60 ℃條件下烘干24 h，再用打粉機把干燥的3種 香辛料打碎，并將處理后得到的香辛料粉過篩(40目)，接著精確稱取香辛料粉末50 g，加入燒杯中，并向其中添加體積分?jǐn)?shù)95%的食用乙醇0.4 L，放置在55 ℃的水浴鍋內(nèi)，使帶轉(zhuǎn)子的攪拌機以600 r/min的速度工作12 h，使用布氏漏斗和真空泵，將提取液，抽濾出來，留下的濾渣再浸提抽提1次。將2次 抽提液混合，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮溫度55 ℃左右，使用真空冷凍干燥機將濃縮液進行凍干，使用真空冷凍干燥機。取出凍干物，并將其碾成粉末，放置在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 哈爾濱風(fēng)干腸的制作

哈爾濱風(fēng)干腸的做法按照孫欽秀等[6]的做法，取豬臀部瘦肉18 kg，肥膘2 kg，放入篩孔直徑1.5 cm的絞肉機中制成肉餡，接著向其中添加食用鹽450 g、亞硝酸鈉1.8 g、麯酒180 g、葡萄糖900 g、谷氨酸鈉54 g、香辛料提取物5.4 g，將混合好的餡料灌入豬小腸中，腸直徑控制在2.5～3 cm，每根腸的質(zhì)量控制在150 g左右。將成品放置在溫度為(25±2) ℃的條件下，通風(fēng)干燥24 h，并控制相對濕度在60%左右。將恒溫恒濕箱調(diào)節(jié)到(25±2) ℃，保持相對濕度為70%～80%，開始發(fā)酵，樣品每隔3 d進行1次試驗。

根據(jù)前期試驗結(jié)果，本試驗共灌制了5 組風(fēng)干腸，把不添加香辛料提取物的試驗作為對照組，肉桂&丁香復(fù)合提取物(質(zhì)量比1∶1)，肉桂&八角復(fù)合提取物(質(zhì)量比1∶1)，丁香&八角復(fù)合提取物(質(zhì)量比1∶1)，肉桂&丁香&八角復(fù)合提取物(質(zhì)量比1∶1)，以添加量0.3 g/kg添加進入腸餡中。每隔3 d對樣品進行生物胺、物化指標(biāo)和微生物數(shù)量的測定，在最后一天時，取產(chǎn)品進行感官評定。

1.2.3 生物胺的測定

生物胺的檢測方法參考SUN等[7]的方法，利用高效液相色譜柱后衍生法，試驗使用高效液相色譜儀并聯(lián)合C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)和熒光檢測器。樣品的進量為10 μL，保持流動相的流速為1 mL/min，衍生劑的流速保持為0.3 mL/min，柱溫控制在40 ℃，衍生池的溫度維持在45 ℃，發(fā)射波長設(shè)置為465 nm，熒光探測器的激發(fā)波長設(shè)定為330 nm。梯度洗脫步驟為：用體積分?jǐn)?shù)為75%流動相A(0.1 mol/L乙酸鈉溶液-10 mol/L辛烷磺酸鈉溶液，pH 5.3)洗10 min，接著在20 min時將流動相A的體積分?jǐn)?shù)下降5%，在38 min時使其體積分?jǐn)?shù)降低到0%，洗脫3 min，然后再在42 min時再用體積分?jǐn)?shù)為75%流動相A進行洗脫。

1.2.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物的測定

依照WANG等[8]做法來測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)值，將2.0 g樣品切成小塊裝入容器中，向每支試管中添加3 mL的TBA溶液，接著再分別加入17 mL 三氯乙酸-鹽酸溶液，混合均勻后，放入沸水鍋中水浴0.5 h，取出后短時間內(nèi)使溫度降至25 ℃，取5 mL處理后產(chǎn)品，向其中加入相同量三氯甲烷，并以3 000 r/min離心10 min，取上清液在532 nm波長下測量OD值。TBARS值是用每千克的樣品中所含丙二醛的毫克數(shù)來計算，如公式(1)所示：

(1)

式中：A532表示在532 nm下測出的OD值；V代表試驗溶液量,mL(此實驗為5 mL)；M代表丙二醛分子質(zhì)量,(g/mol)；ε代表摩爾吸光系數(shù)，數(shù)值為15 200 L/(mol·cm)；l代表光程,cm；m代表待測肉制品質(zhì)量,kg。

1.2.5 微生物的測定

微生物的測定是根據(jù)WANG等[9]的試驗稍作改動，在無菌環(huán)境下，取10.0 g去掉脂肪和結(jié)締組織后切碎的風(fēng)干腸，向其中加入90 mL的生理鹽水，然后進行均質(zhì)2 min。溶液進行10倍梯度稀釋，然后進行培養(yǎng)皿涂布。在37 ℃條件下，在營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上使微生物生長48 h后，進行好氧菌的計數(shù)；在30 ℃的條件下，在乳酸菌培養(yǎng)基上使其生長48 h后進行乳酸菌數(shù)量的統(tǒng)計；在37 ℃的條件下，在結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后進行腸桿菌的計數(shù)。

1.2.6 感官評價

感官評價的方法依照的SUN等[10]的方法，感官評價由受過培訓(xùn)的10名人員參與，所有參加感官評定人員依照7分制原則進行評分，評分具體指標(biāo)包括顏色(7 分為顏色紅潤，有光澤；1 分為顏色暗黑無光澤)、氣味(7 分為具有發(fā)酵肉制品特有的風(fēng)味；1 分為風(fēng)味較差)、滋味(7 分為濃郁的香味；1 分為滋味很差)、酸味(7 分為酸味很重，無法接受；1 分為沒有酸味)、口感(7 分為肉質(zhì)非常硬；1 分為肉嫩)和總體可接受性(7 分為可接受性高；1 分為可接受性低)。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺含量的變化

如圖1所示，隨著發(fā)酵時間的延長，生物胺中酪胺的含量呈增加趨勢(P<0.05)。前3 d的發(fā)酵使酪胺在肉中迅速積累，含量明顯增加，試驗組風(fēng)干腸中酪胺的含量由第0天的1.36 mg/kg迅速增加到19.63～25.22 mg/kg(P<0.05)。而到了第6～9天，酪胺含量增加得不明顯，尤其是對于2種香辛料的復(fù)合的試驗組，在后期酪胺的增長沒有顯著差異(P>0.05)，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時，風(fēng)干腸中的酪胺含量達到最高值28.64～36.96 mg/kg，而未添加復(fù)合香辛料的對照組風(fēng)干腸中酪胺含量則是顯著高于添加香辛料提取物組(P<0.05)。復(fù)合香辛料肉桂&丁香&八角的對于酪胺的生成抑制效果最好，抑制率可以達到22.32%。

人體如果攝入過多的腐胺不但會引起人體的中毒，還會對組胺和酪胺有協(xié)同作用，從而一定程度上增加2種物質(zhì)的毒性[11]。隨著發(fā)酵時間的延長，所有風(fēng)干腸中腐胺的含量呈逐漸增加趨勢，對照組在發(fā)酵第9天時達到51.42 mg/kg，香辛料提取物對腐胺的積累具有不用程度的抑制作用，其中肉桂&八角&丁香組對腐胺的生成抑制效果最好，發(fā)酵結(jié)束其腐胺含量僅為40.52 mg/kg，抑制率可以達到39.52%。

尸胺是6種生物胺中含量最多的，第0天到第3天的發(fā)酵中，因為混入雜菌的風(fēng)干腸中的雜菌(尤其是其中的尸胺陽性菌)由于有機質(zhì)豐富大量繁殖，致使尸胺的含量迅速增加，在第6天到第9天，尸胺的增加速度變得緩慢，這可能是因為風(fēng)干腸中一些有益菌發(fā)酵產(chǎn)生酸性物質(zhì)，這些酸性物質(zhì)的產(chǎn)生與積累，使得pH降低，抑制了一些生物胺陽性菌的生長。同樣，3種香辛料復(fù)合組對尸胺的抑制效果要顯著高于任意2種香辛料提取物復(fù)合的效果(P<0.05)。MAH等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)紅辣椒對發(fā)酵鳳尾魚中尸胺的積累有明顯的抑制作用。

組胺是常見的生物胺中對人體毒性最強的生物胺，如果食用了含有過量組胺的食物，情況較輕時會產(chǎn)生不同程度的頭疼、腹瀉[13]。由圖1-D看出風(fēng)干腸中組胺的含量并不是很高，在發(fā)酵第6天到第9天分別測量風(fēng)干腸中含量為22.32～28.97 mg/kg。但由于組胺的中毒劑量較低，因此發(fā)酵過程中組胺的積累仍不可忽視。組胺的變化趨勢與酪胺和腐胺的相似，肉桂&丁香&八角組對組胺的抑制效果最好，在發(fā)酵第9天時，對組胺的抑制率高達34.2%。CAI等[14]研究發(fā)現(xiàn)小茴香、綠薄荷和丁香提取物對紅鼓魚片中組胺陽性菌的繁殖有較好的抑制作用，進而降低了其組胺的含量。

2-苯乙胺和色胺含量的變化趨勢與尸胺相似，添加香辛料提取物有效抑制了風(fēng)干腸發(fā)酵過程中2-苯乙胺和色胺的積累，其中肉桂&丁香&八角組對2-苯乙胺和色胺的抑制效果最好，至發(fā)酵末期，肉桂&丁香&八角組的2-苯乙胺和色胺分別比對照組低21.86%和20.00%。復(fù)合香辛料提取物具有抑制生物胺的作用，可能是因為肉桂、丁香和八角提取物的抑菌作用抑制了生物胺陽性菌的生長。SUN等[7]研究表明，復(fù)合香辛料提取物中含有的桉樹醇和反式肉桂醛，這些物質(zhì)具有較強的抗菌作用，對許多重要病原體和腐敗菌具有一定的抑制作用。

圖1 不同復(fù)合香辛料提取物風(fēng)干腸在發(fā)酵過程中6 種生物胺的變化Fig.1 Changes in the amounts of six kind of BAs in dry sausages added with different compound spice extracts during fermentation注：圖中不同大寫字母(A～D)表示相同處理組不同發(fā)酵時間組間差異性顯著(P<0.05)，不同小寫字母(a～d)表示相同發(fā)酵時間 不同處理組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 風(fēng)干腸發(fā)酵過程中TBARS的變化

如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的延長,添加和未添加香辛料提取物的風(fēng)干腸中脂肪都發(fā)生了氧化(P<0.05)，脂肪部分氧化會有益于發(fā)酵風(fēng)干腸中形成風(fēng)味物質(zhì)，但是氧化過度就會產(chǎn)生酸敗味或者哈敗味等使人反感的味道。VISESSANGUAN等[15]的試驗表明，不是所有的脂肪氧化都會產(chǎn)生讓人不喜歡的味道，例如在發(fā)酵肉制品中適當(dāng)?shù)闹狙趸€可以使其具有特殊風(fēng)味，我們的試驗也印證了這一點。添加香辛料提取物的風(fēng)干腸的TBARS均比未添加香辛料提取物的組別增加得慢(P<0.05)，發(fā)酵第9天時，加入3種復(fù)合香辛料提取物組的TBARS值最低，比未添加香辛料的組要低28.88%，以上數(shù)據(jù)說明香辛料提取物中的有效成分能很有效地抑制發(fā)酵風(fēng)干腸中脂肪氧化，特別是肉桂&丁香&八角提取物組，這可能是因為香料提取物富含多酚化合物，具有一定的抗氧化性[7]。發(fā)酵第9天，肉桂&丁香&八角提取物組遏制的情況最佳(P<0.05)，至發(fā)酵結(jié)束時，其TBARS值比對照組低28.88%。

2.3 風(fēng)干腸發(fā)酵過程中微生物的變化

如圖3所示，未發(fā)酵時，所有組中的好氧細菌，菌數(shù)為5.42 lg CFU/g，由于發(fā)酵的前3 d風(fēng)干腸中有機質(zhì)含量充分，而對于水分活度較大的風(fēng)干腸，適宜好氧菌生長，使得試驗組與對照組的好氧菌大量繁殖。發(fā)酵第6天到第9天時，好氧菌的繁殖受到了抑制，風(fēng)干腸中好氧菌數(shù)的降低與酸度的增加，水分活度的減少與肉中有機物質(zhì)被消耗有關(guān)。發(fā)酵前3 d，試驗組好氧菌數(shù)的繁殖速度稍微小于未添加香辛料的組別，這是由于香辛料提取物可以阻止細菌的增殖。發(fā)酵第6天到第9天，未添加香辛料提取物的組好氧菌繁殖程度最高，菌數(shù)達7.73 lg CFU/g，添加香辛料提取物的組好氧菌的總數(shù)和未添加香辛料復(fù)合物會有顯著降低(P<0.05)。這說明香辛料提取物有很好的阻止細菌滋生的效果，且3種香辛料提取物組抑制能力最佳。CAI等[14]研究表明添加丁香等浸提油可以有助于紅鼓魚片在貯藏過程中嗜常溫菌的生長。

圖2 不同復(fù)合香辛料提取物風(fēng)干腸在發(fā)酵過程中 TBARS值的變化Fig.2 Changes in TBARS in dry sausages added with different compound spice extracts during fermentation

圖3 不同復(fù)合香辛料提取物風(fēng)干腸在發(fā)酵過程中微生物的變化Fig.3 Changes in bacteria counts in dry sausages added with different compound spice extracts during fermentation

發(fā)酵第3天，各組中乳酸菌的生長速度很高，最終乳酸菌相比較其他菌種生長更優(yōu)，乳酸菌的繁殖可以使產(chǎn)品的酸度升高，這不僅有利于延長產(chǎn)品的貯藏時間，而且可以賦予風(fēng)干腸特殊的風(fēng)味。發(fā)酵的前3 d乳酸菌的繁殖速度很快，發(fā)酵后3 d乳酸菌繁殖速度逐漸減慢，這是由于乳酸菌代謝產(chǎn)生了有機酸，酸度過高，細菌繁殖受到了水分活度降低的阻遏作用。發(fā)酵的全程，試驗組的風(fēng)干腸中乳酸菌繁殖速度較快(P<0.05)，由于除乳酸菌以外其他菌的繁殖受到了香辛料提取物的阻遏作用，減少了其他菌對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，使得乳酸菌的繁殖有環(huán)境的優(yōu)勢，可是在發(fā)酵第9天時，添加與未添加組的差異不顯著(P>0.05)，這表明乳酸菌的繁殖受香辛料提取物的影響較小。

賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶的酶活力在腸桿菌中很高，可以脫羧氨基酸形成尸胺和腐胺[16]。試驗組中腸桿菌的積累與發(fā)酵的時間成負(fù)相關(guān)。未添加香辛料提取物組中腸桿菌被抑制效果最差(P<0.05)，發(fā)酵第9天時，未添加香辛料的組的腸桿菌量最高達到2.06 lg CFU/g，試驗組中腸桿菌的繁殖受到了明顯的阻遏，且3種香辛料組阻遏情況最佳，抑制率可達47.90%，添加2種香辛料的效果稍微較弱，此結(jié)果與生物胺結(jié)論相一致。WANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)向干腌臘肉中添加植物多酚可以有效抑制腸桿菌的繁殖，本研究中可能是由于香辛料提取物富含多酚物質(zhì)，對腸桿菌的生長具有一定的抑制作用。

2.4 感官評價

發(fā)酵第9天后要對產(chǎn)品進行感官評定，感官評定包括色澤、口味、氣味、酸度、口感和產(chǎn)品可接受性等方面，感官評定結(jié)果如表1所示。就色澤來說，試驗組的得分稍微高過于未添加香辛料提取物的組，但是沒有顯著性差異，并且在各個添加香辛料中的處理組之間無顯著性差異(P>0.05)。提取出香辛料的有效成分呈味效果很好，試驗組的產(chǎn)品得分較高的兩項為滋味和氣味，添加了肉桂&丁香&八角提取物打分最高(P<0.05)。酸度這項指標(biāo)，添加復(fù)合香辛料提取物組的分?jǐn)?shù)高于未添加復(fù)合香辛料提取物組，這與香辛料可以抑制雜菌的生長有關(guān)，使得乳酸菌繁殖量增加，繁殖代謝生成乳酸使酸度升高。在口感方面，評分最低的是未添加香辛料復(fù)合提取物組，3種香辛料提取物組被評分最高(P<0.05)，風(fēng)干腸的口感受到很多因素影響影響，如酸度、水分含量、肉的質(zhì)量等[18]。產(chǎn)品可接受性方面，未添加香辛料提取物組評分最低，3種香辛料提取物組獲得分?jǐn)?shù)。3種香辛料提取物加入后，產(chǎn)品中無特殊異味，感官品質(zhì)也有所提高。香辛料中的有效物質(zhì)，其中酚類和萜類有遏制細菌生長、抑制腐敗和防止脂肪氧化作用，有助于香味物質(zhì)生成，可以使食品品質(zhì)得到提升[19]。

表1 不同復(fù)合香辛料提取物發(fā)酵后的風(fēng)干腸感官得分Table 1 Sensory grade of dry sausages added with different compound spice extracts after fermentation

3 結(jié)論

復(fù)合香辛料的添加使得2-苯乙胺、酪胺、組胺、腐胺、色胺和尸胺的形成得到有效抑制，且3種香辛料提取物組阻遏效果明顯優(yōu)于其他復(fù)配組。同時風(fēng)干腸的脂肪氧化、好氧菌和腸桿菌的繁殖均得到了有效的抑制，復(fù)合香辛料提取物的添加能抑制脂肪氧化，同時添加香辛料處理組的感官評定得分較高。綜上，向產(chǎn)品中加入肉桂&丁香&八角復(fù)合香辛料提取物有利于產(chǎn)品的安全生產(chǎn)和品質(zhì)的改善。