祝萍萍 范紅星 梁瑞華 陳江瑛 譚燕萍

【摘要】 目的：研究A型鉀通道亞型Kv1.1在癲癇大鼠海馬神經(jīng)元中的蛋白表達(dá)和電生理功能變化，初步探討Kv1.1在癲癇發(fā)生中的作用和意義。方法：2019年1-12月選取24只成年雄性SD大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組12只。模型組通過向腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品制備癲癇模型，對照組采用0.9%氯化鈉溶液代替處理。每組6只進(jìn)行免疫印記和電生理檢測。利用Western blot方法檢測并比較兩組海馬區(qū)Kv1.1的蛋白表達(dá)。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄并觀察兩組海馬區(qū)錐體神經(jīng)元細(xì)胞膜上總的外向鉀離子電流和Kv1.1介導(dǎo)的鉀電流變化。結(jié)果：模型組海馬區(qū)Kv1.1的蛋白表達(dá)量低于對照組（P<0.05）。全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示：與對照組相比，癲癇模型組海馬區(qū)錐體神經(jīng)元總的外向鉀電流峰值曲線右移，鉀電流峰值從膜電壓-40 mV開始明顯下降（P<0.05）。與對照組相比，模型組海馬區(qū)錐體神經(jīng)元Kv1.1介導(dǎo)的鉀電流峰值曲線右移，峰值從膜電壓-30 mV開始明顯下降（P<0.05）。結(jié)論：癲癇模型中海馬區(qū)Kv1.1的蛋白表達(dá)降低和其介導(dǎo)的鉀電流的下降，提示其表達(dá)變化可能與癲癇的發(fā)生相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 Kv1.1 氯化鋰-匹羅卡品 癲癇

[Abstract] Objective： To study the protein expression and electrophysiological function changes of type A potassium channel subtype Kv1.1 in hippocampal neurons of epileptic rats， and to preliminarily explore the role and significance of Kv1.1 in the occurrence of epilepsy. Method： From January to December 2019， a total of 24 adult male SD rats were selected and divided into control group and model group according to the random number table method， with 12 rats in each group. The model group was prepared epilepsy model by peritoneal injection of Lithium Chloride-Pilocarpine， and the control group was treated with 0.9% Sodium Chloride Solution instead. Immunoimprinting and electrophysiological tests were performed on 6 rats in each group. The protein expression of Kv1.1 in the hippocampus was detected and compared between the two groups by Western blot. The changes of total outward potassium current and Kv1.1-mediated potassium current on the cell membrane of pyramidal neurons in the two groups were recorded and observed by whole cell patch clamp technique. Result： The protein expression of Kv1.1 in the hippocampus of the model group was lower than that of the control group （P<0.05）. Whole-cell patch clamp results showed that， compared with the control group， the peak curve of total outward potassium current of pyramidal neurons in the hippocampus of the model group shifted to the right， and the peak value of potassium current decreased significantly from the membrane voltage -40 mV （P<0.05）. Compared with the control group， the peak curve of Kv1.1-mediated potassium current in the hippocampal pyramidal neurons shifted to the right in the model group， and the peak value decreased significantly from the membrane voltage -30 mV （P<0.05）. Conclusion： The decreased Kv1.1 protein expression in hippocampus and the decreased potassium current mediated by Kv1.1 in the epileptic model suggest that the changes in its expression may be related to the occurrence of epilepsy.

[Key words] Kv1.1 Lithium Chloride-Pilocarpine Epilepsy

癲癇是臨床上常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，其發(fā)病機(jī)制為腦內(nèi)神經(jīng)元的異常放電所致的神經(jīng)細(xì)胞興奮性增高[1]。中樞系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的電壓門控型鉀離子通道（voltage-gated potassium channel，Kv）是動作電位復(fù)極化過程的主要成分，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性方面起著重要作用[2-3]。A型鉀離子電流屬于電壓門控型鉀離子通道家族重要成員之一，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，精細(xì)調(diào)控著神經(jīng)細(xì)胞的各種功能，包括細(xì)胞分化與凋亡、神經(jīng)元的興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信號傳遞等[4-5]。Kv1.1是A型鉀離子通道基因家族的亞族，其開放形成的電流是A型鉀離子電流動作電位復(fù)極化早期外向電流的重要組成部分，可調(diào)節(jié)靜息膜電位的穩(wěn)定性，減慢去極化速度，起到延緩動作電位產(chǎn)生等作用[6]。本研究利用氯化鋰-匹羅卡品建立神經(jīng)興奮性增高的SD大鼠癲癇模型，通過免疫印跡和膜片鉗技術(shù)分析A型鉀通道亞型Kv1.1在海馬區(qū)錐體神經(jīng)元中的表達(dá)和電生理功能，為癲癇的發(fā)病機(jī)制提供新的實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。選取24只周齡為5～8周，

體重200～250 g的SPF級雄性SD大鼠，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0002。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，光照周期為12 h，環(huán)境溫度為25 ℃，濕度為50%～60%，飼養(yǎng)期間自由攝食和飲水。（2）主要試劑和儀器。主要試劑：氯化鋰（生產(chǎn)廠家：美國Sigma公司，貨號：L9650，規(guī)格：100 g），匹羅卡品（生產(chǎn)廠家：上海阿拉丁公司，貨號：P129614，規(guī)格：250 mg），東莨菪堿（生產(chǎn)廠家：上海阿拉丁公司，貨號：S129958，規(guī)格：1 g），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Kv1.1抗體和兔抗大鼠GAPDH抗體購置于英國Abcam公司;DTX-κ購于美國Sigma公司，全蛋白提取試劑盒;BCA蛋白含量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;SDS-PAGE凝膠試劑盒購于廣州展晨生物技術(shù)有限公司;PVDF膜購置于美國Millipore公司。主要儀器：Axonpatch 200B膜片鉗放大器和Digidata 1440A膜片鉗轉(zhuǎn)換器均購于Axon Instrument公司;MP-285微電極操控器、P-97玻璃電極拉制儀和全細(xì)胞膜片鉗玻璃電極均購于Sutter Instrumen公司;防震臺購于Technical Manufacturing Corp;BX51WI正置顯微鏡購于日本Olympus公司;VT1200S腦片震動切片機(jī)購于德國Leica公司;垂直電泳儀購自美國 Bio Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組和制備癲癇鼠模型 實驗時間：2019年1-12月。24只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組12只。模型組采用經(jīng)典的氯化鋰-匹羅卡品癲癇鼠模型制作方法。首先經(jīng)鼠腹腔注射新鮮配制的氯化鋰溶液（180 mg/kg），24 h后腹腔注射東莨菪堿（1 mg/kg），30 min 后再腹腔注射匹羅卡品（30 mg/kg）。如30 min后未出現(xiàn)癲癇發(fā)作的小鼠，可經(jīng)腹腔重復(fù)注射鹽酸匹羅卡品（10 mg/kg）直至誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。對照組采用0.9%氯化鈉溶液代替處理。根據(jù)Racine分級進(jìn)行癲癇發(fā)作評定，判定模型是否成功，模型組均達(dá)Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作。每組6只進(jìn)行免疫印記和電生理檢測。

1.2.2 Western blot 每組6只大鼠經(jīng)麻醉后立即分離海馬，每100 g組織加入1 mL蛋白裂解液，進(jìn)行勻漿、離心，提取上清液即為細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量。采用每孔上樣量為100 μg計算上樣體積，并加入等體積上樣緩沖液，放入100 ℃沸水中煮沸5 min變性，待樣品冷卻至室溫后上樣。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳反應(yīng)，切膠，轉(zhuǎn)至PDVF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，再加入Kv1.1的一抗，抗體稀釋比例為1︰1 000，4 ℃冰箱孵育過夜，次日洗膜后，加入二抗孵育1 h。洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光液ECL試劑反應(yīng)3 min后，保鮮膜包裹，暗室進(jìn)行X光膠片曝光，目標(biāo)條帶密度即為相應(yīng)的蛋白含量。采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)觀察各蛋白條帶，測量目的條帶光密度值，并與GADPH光密度值比較進(jìn)行半定量分析。

1.2.3 全細(xì)胞膜片鉗 （1）鼠海馬腦片制備。每組6只大鼠經(jīng)麻醉后，迅速斷頭取腦，置于用氧混合氣（95%O2+5%CO2）飽和0.5 h以上的0 ℃人工腦脊液（arifieial cerebrospinal fluid，ACSF）中冷卻2～5 min，然后取將腦片以冠狀面垂直固定在振動切片機(jī)的標(biāo)本托上。在0 ℃和氧混合氣條件下，用振動切片機(jī)（參數(shù)：振幅0.9 mm，速度1.7 mm/s，層厚300 μm）將海馬沿長軸平行其橫向的纖維走向切成6～8片。將腦片置于氧混合氣飽和的ACSF中，室溫下孵育60 min待用。分離好的腦片可在4～6 h內(nèi)，保持良好的生理活性狀態(tài)。（2）腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄。將孵育好后的腦片放入腦片記錄浴槽中，持續(xù)灌流已經(jīng)氧混合的ACSF，流速為1～2 mL/min，在室溫下進(jìn)行實驗。在正置顯微鏡和CCD Camera的視野下，用低倍鏡找到腦片海馬，再調(diào)節(jié)高倍鏡選取海馬錐體細(xì)胞層神經(jīng)元。再調(diào)節(jié)微電極操縱器，將沖入正壓的玻璃電極置于腦片皮層上，調(diào)整鉗制模式為電壓鉗模式（V-clamp），在membrane test界面下，選擇邊界清楚、形態(tài)飽滿具有錐體形態(tài)和頂樹突的神經(jīng)元。繼續(xù)將微電極操縱器移至該細(xì)胞，觀察放大器輸出到探頭的去極化測試脈沖（5 mV）形成的測試方波形態(tài)和數(shù)值。當(dāng)數(shù)值增加至少0.1 MΩ時，表示電極尖端與細(xì)胞表面接觸，適度負(fù)壓吸引;當(dāng)封接電阻>1 GΩ時，通過嘴吸或者放大器電擊（ZAP）破膜形成全細(xì)胞記錄。全細(xì)胞記錄形成后，在電壓鉗模式下，鉗制膜電位在-80 mV，給予細(xì)胞躍階電壓刺激，方案如下：給予-100～40 mV躍階電壓刺激，時長為500 ms，step=10 mV。向灌流液中加入1 μM TTX，100 μM CdCl2分別阻斷鈉電流、鈣電流，就可以分離出總的外向鉀離子電流。然后，再向灌流液中加入Kv1.1的特異性阻斷劑DTX-κ（100 nM）阻斷全細(xì)胞外向鉀電流，并給予細(xì)胞上述躍階電壓刺激，將以上得到的兩個電壓鉗圖形使用CLAMPfit軟件相減，就分離出Kv1.1介導(dǎo)的鉀離子電流。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較兩組Kv1.1蛋白相對表達(dá)量。（2）海馬區(qū)總的外向鉀離子電流變化。通過向ACSF中灌流相關(guān)藥物和給予一定的躍階電壓后，分離出了總的外向鉀離子電流。以鉀電流峰值對應(yīng)膜電位繪制曲線，比較對照組和模型組錐體神經(jīng)元鉀通道功能差異。（3）Kv1.1介導(dǎo)的鉀離子電流變化。在分離出總的外向鉀離子電流的基礎(chǔ)上，繼續(xù)加用Kv1.1的選擇型抑制劑DTX-κ，最終得到A型鉀離子電流亞型Kv1.1介導(dǎo)的鉀電流。以Kv1.1介導(dǎo)的鉀電流峰值對應(yīng)膜電位繪制曲線，比較對照組和模型組錐體神經(jīng)元的通道功能差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組海馬區(qū)Kv1.1蛋白表達(dá)量比較 模型組海馬區(qū)Kv1.1蛋白相對表達(dá)量（0.64±0.16）低于對照組（1.61±0.21），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2 海馬區(qū)總的外向鉀離子電流變化 與對照組相比，模型組鉀電流峰值對應(yīng)膜電位曲線右移，鉀電流峰值從躍階電壓-40 mV開始明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3 Kv1.1介導(dǎo)的鉀離子電流變化 與對照組相比，模型組Kv1.1介導(dǎo)的鉀電流峰值對應(yīng)膜電位曲線右移，海馬區(qū)錐體神經(jīng)元Kv1.1介導(dǎo)的鉀離子電流峰值明顯降低，從躍階電壓-30 mV開始明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

3 討論

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)最常見疾病之一，給社會和家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)[7-8]。隨著二代測序技術(shù)的普及，發(fā)現(xiàn)越來越多的基因與癲癇的發(fā)生相關(guān)[9]。其中有約1/4的單基因遺傳性癲癇是由于鉀離子或鈉離子通道基因異常導(dǎo)致的[10]。Kv1.1是由Kcna1基因編碼，屬于A型電壓門控型鉀離子通道家族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是海馬組織中高表達(dá)[11]。Kv1.1通過參與調(diào)節(jié)靜息膜電位的穩(wěn)定性，減慢去極化速度，延緩動作電位，來起到調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞興奮性，以及突觸信號傳遞等重要作用[12]。

Kcna1基因突變致使Kv1.1表達(dá)減少或該通道的電生理特性發(fā)生變化，在該基因敲除的小鼠海馬區(qū)鉀電流明顯降低時，神經(jīng)細(xì)胞興奮性增加，繼而出現(xiàn)癲癇發(fā)作，在人類可引起發(fā)作性共濟(jì)失調(diào)Ⅰ型[13-14]。除了Kv1.1的突變可以導(dǎo)致癲癇外，由此發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞超興奮性可以損害心臟節(jié)律，甚至發(fā)生癲癇性猝死[15]。本研究在經(jīng)典的氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型中，與正常大鼠相比，氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型大鼠Kv1.1的蛋白表達(dá)量明顯降低，全細(xì)胞膜片鉗分離出Kv1.1介導(dǎo)的鉀離子電流峰值幅度顯著下降。推測可能是Kv1.1的蛋白表達(dá)量的減少，進(jìn)一步破壞了Kv1.1通道電生理功能，改變了神經(jīng)元細(xì)胞膜上的離子通道開放和關(guān)閉，使細(xì)胞內(nèi)外鈉-鉀等離子流動性紊亂，導(dǎo)致了該部位的神經(jīng)細(xì)胞興奮性增高，最終出現(xiàn)了臨床上的癇性發(fā)作[16]。這可能是癲癇患者神經(jīng)元興奮性增高的又一重要電生理機(jī)制。

但是，既往也有學(xué)者針對Kv1.1的研究得出相反的結(jié)論，實驗中利用小干擾RNA沉默Kv1.1基因，導(dǎo)致凋亡神經(jīng)元IA的動作電位幅度降低，反而促使神經(jīng)元活性增強(qiáng)。研究者進(jìn)一步加入Kv1.1電流的特異性抑制劑DTX，使Kv1.1電流幅度降低，起到了較好的神經(jīng)保護(hù)作用[17]。為什么Kv1.1在神經(jīng)元興奮性和細(xì)胞損傷調(diào)控中發(fā)揮的作用相異，筆者認(rèn)為，造成上述相反的研究結(jié)果，可能是因為Kv1.1在不同的動物模型和大腦不同組織結(jié)構(gòu)中存在表達(dá)差異，不同層面和水平的研究結(jié)果可能混淆了其中復(fù)雜的精細(xì)調(diào)控。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Kv1.1具有一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，即RNA編輯[18]。目前，在眾多的電壓門控鉀離子通道家族中，僅發(fā)現(xiàn)Kv1.1的A-I RNA編輯在哺乳動物和人類中存在[18]。既往有學(xué)者報道Kv1.1的RNA編輯效率在海人酸誘導(dǎo)的癲癇動物模型的鼻側(cè)皮質(zhì)比正常升高4倍[19]。推測Kv1.1在轉(zhuǎn)錄后過程中可能受到某些因子的影響，才導(dǎo)致蛋白和通道功能產(chǎn)生差異。因此，明確A型鉀離子電流亞型Kv1.1在神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)和細(xì)胞損傷中的作用和機(jī)制至關(guān)重要，本研究的結(jié)果為后續(xù)針對Kv1.1在癲癇發(fā)生機(jī)制的深入研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-05-20） （本文編輯：田婧）