司晶，唐露，李臣誠(chéng)，徐寒梅*

（1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198；2.南京安吉生物科技有限公司，江蘇 南京 210046）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是多種損傷因子持續(xù)作用下的創(chuàng)面愈合反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的累積以及瘢痕的形成為特征[1]。如果不及時(shí)治療，HF 可發(fā)展為肝硬化，并伴有一系列致命并發(fā)癥，如功能性肝功能衰竭、門脈高壓、腹水、肝性腦病，甚至肝細(xì)胞癌等[2]。目前尚無有效治療HF 的藥物獲批上市，唯一可行的治療方法是消除慢性應(yīng)激和肝移植[3]。近年來，越來越多的抗HF 藥物逐步進(jìn)入臨床研究階段。本文對(duì)HF 機(jī)制的最新研究以及抗HF 藥物的研發(fā)現(xiàn)狀進(jìn)行概括和總結(jié)，希望能為今后HF 發(fā)病機(jī)制研究及相關(guān)藥物研發(fā)提供思路。

1 肝纖維化的發(fā)病機(jī)制

1.1 炎癥

炎癥反應(yīng)參與大多數(shù)肝臟疾病的發(fā)病過程，包括病毒感染、化學(xué)性肝損傷、創(chuàng)傷和自身免疫性肝病[4]。炎癥反應(yīng)一開始旨在保護(hù)肝臟免受進(jìn)一步損害，但長(zhǎng)期的炎癥是HF 形成和發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)因素[5]。HF 過程中有許多炎癥相關(guān)通路被激活，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化和肝內(nèi)膠原沉積[5]。

損傷相關(guān)的分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）是健康細(xì)胞中涉及多種細(xì)胞功能的內(nèi)源性因子。當(dāng)肝臟受到刺激、損傷，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，DAMP 被釋放到細(xì)胞外介質(zhì)中，可誘導(dǎo)無菌性炎癥[6]。尤其是肝細(xì)胞壞死，它包含一系列線粒體退化、膜電位損失和ATP 耗盡的過程，其特征是細(xì)胞腫脹、細(xì)胞質(zhì)凝固和細(xì)胞膜破裂，然后在細(xì)胞外環(huán)境中釋放細(xì)胞內(nèi)容物，相比凋亡可產(chǎn)生更多的炎癥信號(hào)[7]。釋放到細(xì)胞外的DAMP 在HF 中發(fā)揮作用的方式復(fù)雜多樣。首先，DAMP 可以直接激活肝巨噬細(xì)胞（Kupffer 細(xì)胞，KC），也可以通過誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的釋放間接作用于肝細(xì)胞、HSC 以及DAMP 自身，來進(jìn)一步誘導(dǎo)HF 的形成和發(fā)展；其次，DAMP 可以促進(jìn)HSC 產(chǎn)生ECM、Ⅰ型膠原蛋白（Col Ⅰ）、纖維連接蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 和-13、金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）-1 等纖維化相關(guān)物質(zhì)，進(jìn)一步激活HSC[6]。

1.2 細(xì)胞因子

多種細(xì)胞因子通過激活HSC 誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM 來參與HF 的形成。如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、腫瘤壞死因子（TNF）等，其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子主要是TGF-β1、PDGF 和IL。

1.2.1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 TGF-β1 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的促纖維化細(xì)胞因子[8]，幾乎涉及HF 的所有關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TGF-β1 主要通過3 種機(jī)制促進(jìn)肝纖維的形成：1）TGF-β1 通過抑制MMP 以及促進(jìn)TIMP 的活性來抑制ECM 降解；2）TGF-β1 通過上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的形成；3）TGF-β1 通過Smad 通路依賴性和非依賴性相關(guān)機(jī)制誘導(dǎo)ECM 的生成[9]。TGF-β1 對(duì)HSC 的主要作用是通過上調(diào)Notch 通路和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)刺激靜止HSC 向活化的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)HSC 合成過量的基質(zhì)蛋白，如纖連蛋白和Col Ⅰ、Col Ⅲ、Col Ⅳ[10]。TGF-β1 還 可 通 過HSC的AGAP2 因子介導(dǎo)來誘導(dǎo)PDGF 轉(zhuǎn)錄水平升高，促進(jìn)PDGF 表達(dá)，從而間接促進(jìn)HSC 的增殖[11]。

1.2.2 血小板衍生生長(zhǎng)因子 PDGF 是HF 進(jìn)展中的關(guān)鍵分子之一。在肝損傷期間，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）、肝巨噬細(xì)胞（Kupffer Cell，KC）和活化的HSC 均能表達(dá)PDGF[12]。PDGF 受體（PDGFR）在HSC 膜上表達(dá)，通過自分泌機(jī)制刺激HSC 的活化[13]。PDGF 結(jié)合在相應(yīng)的受體上，誘導(dǎo)受體二聚和磷酸化，進(jìn)而磷酸化細(xì)胞內(nèi)不同底物上的酪氨酸殘基。PDGFR 的刺激可激活多種信號(hào)通路，包括Ras/Raf 系統(tǒng)、磷脂酶C γ（PLCγ）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）通路以及Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）通路。這些下游信號(hào)調(diào)節(jié)相關(guān)促纖維化因子的表達(dá)水平，如Col Ⅰ、MMP、TIMP 以及凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2，從而促進(jìn)HSC 的增殖和存活[14]。

1.2.3 白細(xì)胞介素 IL 在HF 中發(fā)揮的作用主要分為促炎和抗炎兩部分。IL-1 和IL-17 家族是重要的促炎因子。IL-1 包含IL-1α、IL-1β 等18 個(gè)成員，主要通過上調(diào)MMP9、MMP13 和TIMP-1 來促進(jìn)HSC的成纖維特性。IL-1α 和IL-1β 協(xié)同促進(jìn)HF。有研究證明，阻斷這兩者的表達(dá)可以緩解大鼠的HF[15]。IL-17 通過2 種不同的機(jī)制發(fā)揮其促纖維化作用：1）IL-17 可以誘導(dǎo)KC 和其他巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-1β、TNF-α 和TGF-β1，間接激活HSC；2）IL-17也可以通過促進(jìn)HSC 中Col Ⅰ的沉積及α-SMA和TGF-β1 等纖維化相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)來直接激活HSC[16]。

IL-10 和IL-22 在HF 中發(fā)揮抗炎作用[17]。在最近的一項(xiàng)研究中，IL-10 被證明可通過上調(diào)p53 和p21 的表達(dá)來誘導(dǎo)活化的HSC 死亡[18]。另一種抗炎細(xì)胞因子IL-22 激活HSC 中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3），促進(jìn)HSC 衰老，誘導(dǎo)其死亡。同時(shí)，IL-22 通過抑制HSC 中的TGF-β1/Notch 信號(hào)通路來抑制HSC 的活化[19]。

IL-6 是一種多效性細(xì)胞因子，主要由KC 產(chǎn)生，在急性和慢性炎癥中發(fā)揮的作用相反，即促炎或抗炎。IL-6 是STAT3 的主要激活因子，IL-6/STAT3 信號(hào)通路與HF 的形成和HSC 的活化相關(guān)[20]。

1.3 整合素

整合素（integrin）是由α 和β 2 個(gè)亞基以非共價(jià)連接形成的一個(gè)跨膜異二聚體蛋白家族，通過細(xì)胞膜傳遞雙向信號(hào)，是ECM 成分的主要受體[21]。整合素參與細(xì)胞黏附和維持組織完整性，在細(xì)胞存活、增殖、分化、遷移等生物學(xué)過程中也發(fā)揮重要作用[22]。在HF 進(jìn)程中，整合素主要與ECM 蛋白結(jié)合，激活下游信號(hào)通路中的相關(guān)成員：1）生長(zhǎng)因子受體，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、PDGF；2）細(xì)胞因子受體，如影響細(xì)胞行為的IL-3；3）細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)配體，如p130Cas、Grb2；4）胞質(zhì)酪氨酸激酶，如Src 家族激酶（SFK）及黏著斑激酶（FAK）[23]。這些被激活的受體、細(xì)胞因子直接或間接地激活HSC 以及其他成纖維細(xì)胞增殖分化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子以及ECM 釋放，加快HF 的發(fā)生發(fā)展。

整合素家族由18 個(gè)α 亞基和8 個(gè)β 亞基通過不同的組合方式組成，已有24 種組合形式被發(fā)現(xiàn)[22]。正常組織中，TGF-β1 與潛在相關(guān)肽（LAP）以1∶1 結(jié)合成復(fù)合物的形式儲(chǔ)存在ECM 中，沒有活性[23]。這些整合素能夠識(shí)別并結(jié)合TGF-β1 上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，從而激活TGF-β1，發(fā)揮促纖維化的作用[24]。成纖維細(xì)胞主要表達(dá)4 種包含av 亞單位的整合素：avβ1、avβ3、avβ5 和avβ8。研究發(fā)現(xiàn)，使活化的成纖維細(xì)胞丟失所有的含av 亞單位整合素，可以保護(hù)小鼠包括肝臟在內(nèi)的多個(gè)器官免受纖維化，并且這種作用與組織中TGF-β1 信號(hào)的減少有關(guān)[23]。其中，avβ1 由于難以制備抗體，其功能一直被忽略。Reed 等[24]通過特殊方式制備avβ1 抑制劑，研究證明avβ1 是幾種原代成纖維細(xì)胞上的主要整合素，在HF 進(jìn)程中TGF-β1 的活化步驟發(fā)揮重要作用。通過抑制avβ1可以很好地治療博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化以及四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠HF。這項(xiàng)研究提示，除了avβ3、avβ5 和avβ8 之外，avβ1 也是治療HF 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 以肝星狀細(xì)胞為中心的各類型細(xì)胞在肝纖維化中的作用

HF 的形成原因復(fù)雜多樣，發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。隨著對(duì)HF 的研究深入，不斷有新的參與HF的細(xì)胞、因子、蛋白、信號(hào)通路等被研究發(fā)現(xiàn)。但自1971 年HSC 與HF 的關(guān)系被發(fā)現(xiàn)以來，其在HF中的主角地位從未被撼動(dòng)。大多數(shù)HF 是由HSC 的激活驅(qū)動(dòng)的。HSC 又稱Ito 細(xì)胞、肝臟貯脂細(xì)胞，位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的竇周（Disse）間隙內(nèi)，約占肝臟細(xì)胞的10%[25]。生理狀態(tài)下，HSC表現(xiàn)為非增殖的靜止表型，細(xì)胞質(zhì)富含維生素A 脂滴[26]。受到外界刺激時(shí)，HSC 從靜止向具有高增殖、成纖維性和收縮性的肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)降低儲(chǔ)存維生素A 的能力。激活的HSC 轉(zhuǎn)化為的肌成纖維細(xì)胞是肝纖維化中肌成纖維細(xì)胞的主要來源，約占各種慢性肝病中肌成纖維細(xì)胞的82% ～96%[27]。HSC 活化后分泌大量的ECM 蛋白，釋放一系列促炎因子（如IL-6 等）以及促纖維化因子（如TGF-β1）[28]，并高表達(dá)α-SMA、膠原蛋白、波形蛋白、骨橋蛋白、賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）以及TIMP-1[29]。因此，活化的HSC 一直被看作治療HF 的主要靶點(diǎn)。

1.4.1 肝星狀細(xì)胞的活化 一般情況下，HSC 活化分為2 個(gè)階段：初始活化和永久活化。如果誘導(dǎo)纖維化的因素消失，活化的HSC 可能會(huì)發(fā)展到第3 階段：消退。在此階段它們可能會(huì)發(fā)生凋亡、衰老或恢復(fù)到靜態(tài)表型[26]。在起始階段，HSC 接收分泌成纖維細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的鄰近細(xì)胞發(fā)出的分子信號(hào)，增強(qiáng)HSC 向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及分泌促纖維化因子的特性?；罨?，HSC 不斷增殖并大量分泌ECM 蛋白，導(dǎo)致ECM 積累以及瘢痕形成。這個(gè)過程是永久且難以逆轉(zhuǎn)的[26]。

HF 中發(fā)生的幾乎所有變化都會(huì)影響HSC 的行為，誘導(dǎo)HSC 活化。HSC 與肝細(xì)胞、LSEC、肝巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）、膽道上皮細(xì)胞（BEC）、肝祖細(xì)胞（HPC）以及血小板等形成一個(gè)相互影響的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)[30]。某個(gè)細(xì)胞一旦發(fā)生變化，釋放的趨化因子和分子信號(hào)便會(huì)直接或間接影響HSC 的狀態(tài)，通過抑制或激活HSC 調(diào)節(jié)HF 的進(jìn)展。因此，理解HSC 與其他細(xì)胞之間的相互作用，闡明它們?cè)贖F 進(jìn)程的不同階段的相互影響，對(duì)于HF 的治療至關(guān)重要[26]。

1.4.2 肝細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響 肝細(xì)胞是肝臟最豐富的細(xì)胞類型，易受各種有害物質(zhì)的損害，如酒精、病毒感染、有毒化合物等，誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放一系列炎癥因子，如活性氧（ROS）[31]、Hedgehog（Hh）[32]、核苷酸、DAMP[6]等，直接或間接促進(jìn)HSC 的活化。HSC 能夠吞噬肝細(xì)胞凋亡小體，誘導(dǎo)HSC 向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[26]。受損肝細(xì)胞的外泌體可介導(dǎo)Toll 樣受體3（TLR3）的激活，增強(qiáng)HSC 中IL-1 和IL-23 的表達(dá)。此外，肝細(xì)胞中脾臟酪氨酸激酶（SYK）和PDGFRα 的上調(diào)可直接改變這兩者在HSC 中的表達(dá)，調(diào)節(jié)HSC 的活化和增殖[32]。

1.4.3 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化發(fā)展中的作用 LSEC 是肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞群，約占肝細(xì)胞的15% ～ 20%[33]。肝實(shí)質(zhì)由LSEC 排列形成的高效血管網(wǎng)絡(luò)支持。LSEC 表型的改變，包括LSEC 窗口缺失、毛細(xì)血管化和形成有組織的基底膜，已被證明是HF 形成的先兆[34]。LSEC 與肝細(xì)胞、HSC 相互作用，促進(jìn)蛋白、脂質(zhì)和糖代謝[35]。在正常肝臟中，肝細(xì)胞和HSC 旁分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）刺激的一氧化氮（NO）依賴性途徑和NO 非依賴性途徑都是維持LSEC 分化表型所必需的[36]。肝損傷后，LSEC 釋放不同的血管分泌信號(hào)來平衡肝臟再生和纖維化，最終維持肝臟穩(wěn)態(tài)。LSEC 的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）-1 受到肝臟慢性損傷因素的激活而驅(qū)動(dòng)纖維血管的形成，從而促進(jìn)HF 的發(fā)生和發(fā)展[37]。受損的LSEC 逐漸毛細(xì)血管化，失去基底膜的窗孔。毛細(xì)血管化的LSEC 失去保護(hù)肝組織和滅活HSC 的能力，促進(jìn)肝內(nèi)血管收縮和HF 的形成[35]。而活化的HSC 分泌過多的ECM，導(dǎo)致內(nèi)皮開窗功能喪失和LSEC 功能障礙，進(jìn)一步促進(jìn)HF。鑒于LSEC 在HF 中發(fā)揮的作用，保護(hù)LSEC 可能是減輕HF 的有效策略。

1.4.4 肝巨噬細(xì)胞對(duì)肝纖維化的雙重作用 KC 具有促進(jìn)或抑制HF 的雙重功能。KC附著在竇狀內(nèi)皮層，可被血液循環(huán)的多種刺激激活，并分泌多種細(xì)胞因子，包括TGF-β1、TNF-α、MCP-1、趨化因子（如CCL3 和CCL5）和其他可溶性介質(zhì)，對(duì)其他肝細(xì)胞產(chǎn)生影響[38]。KC 雙向調(diào)控HSC 的激活。一方面，KC 通過分泌IL-1 和TNF-α 作用于核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路來促進(jìn)HSC 的活化。用柳氮磺胺吡啶誘導(dǎo)HSC 凋亡來抑制NF-κB 通路，可以發(fā)揮抗纖維化的作用[39]。抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可以直接抑制HSC 的活化和HF 的發(fā)生[40]。另一方面，KC 可以通過H2O2-IL-6 機(jī)制負(fù)向調(diào)控HSC 的成纖維性反應(yīng)，還可以通過分泌MMP 來限制HF[41]?；谀壳暗难芯?，尚不清楚為何KC 對(duì)HSC 有2種相反的作用。進(jìn)一步闡明KC 與HSC 激活之間的關(guān)鍵觸發(fā)機(jī)制，將有利于精準(zhǔn)干預(yù)KC 對(duì)HF 的作用。

還有很多其他細(xì)胞可對(duì)HSC 的活化和HF 的形成產(chǎn)生影響。研究表明，NK 細(xì)胞通過殺死活化的HSC 并產(chǎn)生干擾素（IFN）-γ 發(fā)揮抗纖維化的作用[42]，NK 外泌體可抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的HSC 的增殖和活化；膽管細(xì)胞（BEC）通過產(chǎn)生Hh 配體調(diào)節(jié)EMT，直接促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)[43]。BEC 的增殖和旁分泌可以促進(jìn)HSC 的活化和增殖。此外，BEC 自身可在TGF-β1 的誘導(dǎo)下向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致膽管纖維化[44]。

2 肝纖維化相關(guān)治療藥物

在我國(guó)，肝病是常見病和多發(fā)病，主要包括乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。HF 是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，然而目前尚無有效治療藥物獲批。處于Ⅱ期和Ⅲ期臨床研究階段的HF 治療藥物有20 多種，包括吡非尼酮、CsA-TAC、Candesartan等（見表1）。截至目前，已有三家公司公布關(guān)鍵Ⅲ期研究結(jié)果：Intercept 公司的法尼醇X 受體激動(dòng)劑奧貝膽酸（商品名：Ocaliva）獲得成功，F(xiàn)DA 已接受新藥上市申請(qǐng)（NDA），并授予優(yōu)先審評(píng)資格；吉利德的凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）抑制劑selonsertib 的兩項(xiàng)關(guān)鍵Ⅲ期研究被宣告失?。?020年5 月11 日，Genfit 公司宣布在治療非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的Ⅲ期研究中，elafibranor 較安慰劑未能顯著改善患者NASH 組織學(xué)癥狀和減緩不斷加劇的肝臟纖維化，以失敗告終。

表1 肝纖維化治療藥物臨床研究情況Table 1 Clinical study of drugs for the treatment of liver fibrosis

3 結(jié)語(yǔ)

HF 是一個(gè)復(fù)雜的過程，各種細(xì)胞、趨化因子、分子信號(hào)等相互作用，形成一個(gè)龐大的互相影響、互相反饋的網(wǎng)絡(luò)。其中HSC 的激活是各種相互作用的最終結(jié)果。因此，研究HF 的發(fā)病機(jī)制歸根結(jié)底是研究HSC 的活化機(jī)制。近幾年新發(fā)現(xiàn)，miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）和外泌體等也參與HSC 的活化。正是由于HF 的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，靶向其中的某一個(gè)靶點(diǎn)或某一環(huán)很難有效發(fā)揮抗HF作用。因此，解密HSC 活化過程中細(xì)胞、因子、信號(hào)通路間相互作用的特殊機(jī)制，對(duì)于HF 的治療干預(yù)至關(guān)重要。