袁前發(fā) 徐志忠 王文強(qiáng) 朱敬敬 溫春燕 段海珍 閆曉娜 何 玨

1.廈門市仙岳醫(yī)院精神衛(wèi)生研究室，福建廈門 361000；2.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院康復(fù)科，河南新鄉(xiāng) 453000；3.廈門市海滄醫(yī)院急診科，福建廈門 361000；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，福建福州 350000

抑郁癥屬于精神類的一種常見疾病，世衛(wèi)組織將其確定為世界第四大疾病，因其具有高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高致死率等特征，因而其在全球范圍內(nèi)是一個負(fù)擔(dān)性疾病[1-2]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制的假說主要有四種：單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說[3-4]、神經(jīng)營養(yǎng)假說[5-6]、垂體-下丘腦-腎上腺皮質(zhì)軸紊亂假說[7]和細(xì)胞因子假說[8-9]。其中細(xì)胞因子假說認(rèn)為抑郁癥是一種免疫紊亂性疾病，強(qiáng)調(diào)免疫系統(tǒng)在發(fā)生和發(fā)展過程中的作用，某些應(yīng)激刺激引起免疫系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致細(xì)胞因子異常分泌，進(jìn)而從多個層面影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10]。而細(xì)胞因子又分為前炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子，但這兩種炎癥細(xì)胞因子的改變是否與抑郁癥的發(fā)生有必然聯(lián)系暫未有明確的研究報告。同時，抑郁癥模型的構(gòu)建過程中大多會衡量動物體重的變化，但體重變化與抑郁癥的關(guān)系并不十分明確。因此，本實驗采用慢性不可預(yù)見應(yīng)激刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）構(gòu)建抑郁癥模型，在模型的構(gòu)建過程中觀察小鼠體重的動態(tài)變化，并檢測血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin- 6，IL-6）和白介素10（interleukin-10，IL-10）水平來驗證是否與抑郁癥發(fā)生具有關(guān)聯(lián)性，最后從小鼠相關(guān)行為學(xué)實驗評價此模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與分組

1.1.1 藥品與試劑 TNF-α、IL-6 和IL-10 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒，購于上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號分別為JL10484、JL20268、JL18442。

1.1.2 儀器 全自動酶標(biāo)儀購于美國 Bio-Rad 公司（生產(chǎn)型號：168-1130）。

1.1.3 實驗動物 實驗動物選用BALB/c 雄性小鼠，8 周齡，體重18 ～20g，由廈門大學(xué)實驗動物中心提供，其購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK（京）2016-0006，動物實驗獲得廈門大學(xué)實驗動物倫理委員會授權(quán)。小鼠飼養(yǎng)于濕度 40%～50%、溫度（24.0±1.0）℃的通氣籠系統(tǒng)中。

1.1.4 實驗分組 42 只無特定病原體級小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，小鼠禁食12 h 后按照體重隨機(jī)分為兩組，即對照組（7 只）和模型組（35 只）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠抑郁模型構(gòu)建[11]對小鼠進(jìn)行單籠孤養(yǎng)，并給予每天包括固定在塑料管內(nèi)、鼠籠傾斜、不筑巢、擁擠環(huán)境、明暗顛倒、白噪聲，共6 種刺激方法，每日2 種，每種刺激出現(xiàn)1 次，同樣刺激方式不同時出現(xiàn)，按照隨機(jī)原則分布各個應(yīng)激周期中。見表1。

1.2.2 體重動態(tài)監(jiān)測 實驗動物每隔兩天監(jiān)測一次體重，并通過以下計算公式計算其體重變化。體重變化=第n 天的體重－第1 天的體重（0 ＜n≤28）。

1.2.3 強(qiáng)迫游泳實驗 迫使小鼠在裝有 15 cm 水（水溫保持 22 ～23℃）的透明塑料圓筒中游泳6 min，記錄后4 min 內(nèi)不動時間。不動的標(biāo)準(zhǔn)是垂直漂浮在水中，同時僅進(jìn)行那些必要的動作以將頭保持在水上，實驗結(jié)束后，將小鼠移出并在加熱燈下加熱直到其身體干燥。

1.2.4 蔗糖偏好 實驗小鼠適應(yīng)性習(xí)慣兩個飲水瓶3 d 后，將每只小鼠單獨分籠，每籠中放置兩個飲水瓶，一個為1%蔗糖瓶，另一個含水瓶，測量水和蔗糖溶液攝入量的體積，同時每天更換兩個瓶子的位置以減少實驗誤差。計算公式為蔗糖偏好= V蔗糖溶液/[V蔗糖溶液+ V水]×100%。

表1 CUMS模型不同程序刺激表

1.2.5 曠場實驗 小鼠放置在尺寸為 90 cm×90 cm×30 cm 的木箱（內(nèi)部劃分為36 個大小相同的正方形）中5 min，用 ANY-maze 軟件記錄和分析小鼠在測試時間內(nèi)穿越中間方格的次數(shù)。實驗完成后將小鼠取出，在木箱內(nèi)噴灑10%的乙醇溶液清潔儀器，以消除其運(yùn)動痕跡對后面測試的影響。

1.2.6 血清標(biāo)本采集 采用眼眶取血，血液采集后常溫靜置2 h，采用3000 r/min 離心10 min，收集血清，置于-80℃低溫冰箱中保存至檢測。

1.2.7 TNF-α、IL-6 和IL-10 含量測定 用 ELISA試劑盒測定各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-10 含量，所有操作按試劑盒所附說明書檢測，根據(jù) ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中3 個指標(biāo)的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)均以（）表示，統(tǒng)計結(jié)果以O(shè)rigin Pro 8 作圖，組間兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠的體重動態(tài)變化比較

造模4 d 后，對照組和模型組小鼠體重開始出現(xiàn)差異，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模第4 ～24 天時，對照組和模型組小鼠體重差異進(jìn)一步加大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模第24 天后，模型組小鼠體重明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。小鼠體重變化見圖1。

圖 1 兩組小鼠的體重動態(tài)變化

2.2 兩組小鼠行為學(xué)實驗結(jié)果比較

小鼠行為學(xué)實驗結(jié)果見圖2。造模28 d 后，模型組小鼠在強(qiáng)迫游泳實驗中不動時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A；糖偏好實驗中，與對照組小鼠比較，模型組小鼠糖偏好程度明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B；曠場實驗中，模型組小鼠穿越實驗中心次數(shù)較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C。

圖2 兩組小鼠的行為學(xué)實驗結(jié)果比較

2.3 兩組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10含量變化比較

前炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 與對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），抗炎癥細(xì)胞因子IL-10 含量與對照組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表 2 兩組小鼠血清中TNF-α，IL-6和IL-10含量比較（±s，mmol/L）

表 2 兩組小鼠血清中TNF-α，IL-6和IL-10含量比較（±s，mmol/L）

組別 n TNF-α IL-6 IL-10對照組 7 5.81±2.69 1.35±0.81 1.69±0.80模型組 35 21.08±3.22 2.73±0.67 0.83±0.53 t 值 5.149 2.490 2.444 P 值 0.001 0.034 0.040

3 討論

CUMS 是模擬抑郁癥的環(huán)境誘因，其主要通過對周圍環(huán)境改變誘發(fā)動物行為異常而建立的抑郁動物模型，其可以模擬人類抑郁癥的主要臨床癥狀，作用持久且穩(wěn)定，因而被廣泛應(yīng)用[12-13]。有研究表明，CUMS 模型構(gòu)建過程中，隨著造模時間的延長，其體重會出現(xiàn)不同程度的差異[14-15]。但究其原因，各學(xué)者看法不一，部分學(xué)者認(rèn)為模型組鼠體重減輕是由于出現(xiàn)情感抑郁，食欲不佳等原因?qū)е麦w重增加變慢；另有研究認(rèn)為模型組鼠體重減輕是因為在CUMS 造模過程中曾給予了禁食禁水等刺激，導(dǎo)致大鼠體重增長緩慢[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，0 ～4 d 時，兩組小鼠體重呈現(xiàn)直線增長，然而隨著刺激時間的延長，也就是造模處于5 ～24 d 的時候，模型組小鼠其體重增長趨勢明顯降低，可能是已經(jīng)出現(xiàn)輕度抑郁，特別是第24 天時，模型組鼠較對照組鼠體重明顯下降（P＜0.05），提示造模末尾階段，模型組鼠可能已經(jīng)處于抑郁狀態(tài)，表明抑郁過程中其體重變化可以作為一個評價抑郁狀態(tài)的參考指標(biāo)，為抑郁癥的研究提供一定的參考依據(jù)。但本研究也有一些不足，未能在第24 天時檢測行為學(xué)變化，用以進(jìn)一步明確小鼠此時的抑郁狀態(tài)，課題組將在后續(xù)實驗中完善這一驗證。

免疫炎癥反應(yīng)在抑郁癥發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，炎癥反應(yīng)實質(zhì)上是機(jī)體與致炎因子進(jìn)行抗?fàn)幍耐庠诒憩F(xiàn)，而抑郁癥免疫方面的研究集中在細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞方面[16-18]。細(xì)胞因子分為前炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子，前炎癥細(xì)胞因子在抑郁癥中的改變和作用近年來成為相關(guān)熱點研究[10]；抗炎癥細(xì)胞因子因其可能具有抗抑郁作用，日益受到研究者的關(guān)注[19-21]。本研究選用TNF-α、IL-6 和IL-10 進(jìn)行監(jiān)測，實驗結(jié)果顯示，在抑郁癥小鼠模型中前炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 與對照組比顯著升高，抗炎癥細(xì)胞因子IL-10 含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明抑郁癥的發(fā)生與免疫系統(tǒng)的失衡有關(guān)，抑郁癥發(fā)生能夠激活免疫系統(tǒng)，從而引起相關(guān)炎癥因子水平的改變，為抑郁癥的治療提供了新的研究思路，雖然本研究未對炎癥因子和抑郁癥的相關(guān)性進(jìn)行驗證，但本研究論證了炎癥因子在抑郁癥的發(fā)生過程重要性，為抑郁癥發(fā)病機(jī)制和治療手段提供了新的研究基礎(chǔ)，后期課題組將進(jìn)一步論證炎癥因子和抑郁癥的相關(guān)性，并明確具體的參與過程。

綜上所述，CUMS 所致小鼠抑郁模型能夠較好模擬抑郁過程，小鼠體重差異最早可在造模24 d 開始出現(xiàn)，且隨時間延長差異越顯著，而且CUMS 所致BALB/c 小鼠抑郁可能與炎癥因子的異常表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果可為抑郁癥的早期臨床治療和診斷提供相關(guān)的研究參考依據(jù)，可根據(jù)這一特征在抑郁癥發(fā)病早期進(jìn)行藥物或治療手段的干預(yù)，避免病程的進(jìn)一步加深。