孫 雨，劉亞濤，王睿男，蔣 菲，馬 英，李秀梅，王 文，原小燕，顧小雪，王傳彬

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830000；3.洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司，河南洛陽 471000）

禽白血病病毒又稱禽C 型腫瘤病毒，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科禽C 型反轉(zhuǎn)錄病毒屬。禽白血病病毒和肉瘤病毒緊密相關(guān)，因此又稱禽白血病/肉瘤病毒。自然情況下，該病毒可感染家養(yǎng)雞、野雞（珍珠雞）、鵪鶉、鷓鴣等禽類。4～10 月齡母禽發(fā)病較多，性成熟或即將性成熟的禽群容易發(fā)病。該病呈世界性分布，在我國福建、廣東、廣西以及山東等地方品系雞群中均有不同程度的發(fā)生[1]。不同品種的雞對該病毒易感性差異較大，AA 雞與艾維茵雞的易感性明顯高于新布羅雞、羅斯雞、京白雞[2]。該病感染率高，容易引起病禽發(fā)育遲緩、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降，引發(fā)多組織腫瘤甚至死亡，嚴重影響禽群生產(chǎn)能力，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病[3]。禽白血病還可間接導致其他疫苗免疫失敗，對肉雞、蛋雞和種雞生產(chǎn)影響較大[4]。目前，對于禽白血病尚無有效的疫苗和防治藥物。世界上一些養(yǎng)禽大國控制該病的主要策略是，對禽群實施禽白血病病原監(jiān)測，凈化種禽，通過逐步凈化達到純化種禽群目的[5]。

禽白血病病毒蛋白組分主要由gag基因編碼的核心蛋白、pol基因編碼的各種酶以及env基因編碼的糖蛋白組成。其中g(shù)ag基因主要編碼非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白。這些非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白由基質(zhì)蛋白、蛋白酶、衣殼和核衣殼4 種成分組成，分別稱作p19、p15、p27 和p12 蛋白。p27 是病毒的衣殼蛋白，在蛋白總含量中占比高達30%，具有很多適合檢測的抗原表位，因此很多方法都以檢測p27 抗原來判定是否有禽白血病病毒感染[6]。目前國外用于檢測禽白血病病毒p27 抗原的試劑盒，主要為美國IDEXX 公司生產(chǎn)的p27 抗原ELISA 檢測試劑盒。國內(nèi)應(yīng)用較多的主要是揚州大學、中國動物疫病預(yù)防控制中心、北京世紀元亨公司聯(lián)合研發(fā)的禽白血病雙抗體夾心法p27 抗原ELISA 檢測試劑盒、禽白血病雙抗體夾心法p27 抗原膠體金檢測試紙條。此外，中國農(nóng)業(yè)科學院研制的禽白血病病毒p27 抗原檢測試劑盒正在推廣應(yīng)用中[6-7]。

本研究利用已制備的2 株p27 蛋白單克隆抗體，建立雙抗體夾心檢測抗原的方法，以檢測樣品中禽白血病病毒。將p27 蛋白單克隆抗體包被于熒光層析試紙條，與樣品中的待檢抗原和另外一種經(jīng)鑭系元素熒光微球標記的p27 蛋白單克隆抗體，形成“固相單克隆抗體-抗原-熒光微球標記的單克隆抗體”免疫復(fù)合物。通過洗滌，除去未結(jié)合微球標記的單克隆抗體，然后讀取熒光微球發(fā)光值，計算p27 抗原的計量值，從而定量檢測家禽樣本中禽白血病抗原含量，以此判定陰陽性結(jié)果。本試驗由檢測結(jié)果定量讀取被檢動物體內(nèi)禽白血病病毒抗原含量，具有較高的實用和基層推廣價值。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

BSA 與脫脂奶粉，購自美國Oxoid 公司；比對用禽白血病病毒抗原ELISA 檢測試劑盒，購自美國IDEXX 公司（貨號HR786，批號99-09254）；禽白血病病毒p27 融合蛋白，由中國動物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）制備保存；鑭系熒光微球、高敏熒光定量檢測系統(tǒng)，均由洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司研發(fā)制備；禽白血病陰陽性臨床樣本、禽白血病病毒相關(guān)單克隆抗體、大腸桿菌菌體裂解液、H7N9 亞型流感病毒、H5 亞型禽流感病毒、新城疫CS2 病毒等交叉試驗樣品及禽白血病病毒p27、p12、p15、gp85重組表達蛋白，均由中國動物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）保存[8]；胎牛血清、細胞培養(yǎng)基以及其他相關(guān)細胞培養(yǎng)試劑，購自美國Gibco 公司；健康BALB/c 小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；高效連續(xù)點膜機，購自杭州峰航科技有限公司；便攜式熒光免疫分析儀，購自洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)有限公司。

1.2 p27 蛋白單克隆抗體細胞株的復(fù)蘇與鑒定

1.2.1 雜交瘤細胞擴繁 參照本課題組已經(jīng)發(fā)表的文獻[9]，從液氮中取出雜交瘤細胞株2E5 和3D5，置于37 ℃水浴鍋中迅速解凍；用含有20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液制成細胞懸液平鋪于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～72 h，進行分裂繁殖；穩(wěn)定后待其長成細胞單層，取生長良好的單層細胞，胰酶消化后用適量含20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液吹懸細胞，按照體積比1:3 接種到新細胞培養(yǎng)瓶中，補充細胞培養(yǎng)液至20 mL/瓶，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36～72 h。

1.2.2 腹水制備 將擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞以1 000 r/min 離心5 min，棄掉細胞培養(yǎng)上清；用RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸，進行細胞計數(shù)，隨后將細胞濃度稀釋至15×106個/mL；取健康BALB/c 小鼠，將培養(yǎng)好的雜交瘤細胞注射至小鼠腹腔內(nèi)，注射量為100 μL/只；觀察10～15 d，待小鼠腹部明顯腫大后，采集腹水。

1.2.3 腹水純化 采用飽和硫酸銨沉淀方法對腹水進行純化，將純化后的p27 單克隆抗體無菌定量分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western Blot 檢測純化后單克隆抗體與p27蛋白反應(yīng)特異性 對禽白血病病毒p27、p12、p15、gp85 融合蛋白進行SDS-PAGE 電泳，檢測蛋白純度，通過BCA 蛋白濃度測定法定量濃度；將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，然后經(jīng)5%脫脂牛奶封閉2 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min；采用純化后的2 株p27 單克隆抗體（稀釋比例1:3 000）作為一抗孵育過夜，PBST 洗滌3 次，每次5 min；以HRP 標記的兔抗小鼠抗體作為二抗（稀釋比例1:4 000）孵育1 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min；利用HRPDAB 底物顯色試劑盒顯色，室溫（15～25 ℃）作用5 min，以清水終止。

1.3 樣本采集及處理

1.3.1 蛋清樣品 取禽蛋破碎后的蛋清，于 -20 ℃與室溫之間反復(fù)凍融，吸取蛋清進行檢測。

1.3.2 泄殖腔拭子樣品 用棉簽取待檢雞只泄殖腔樣本，置于1～2 mL 樣品稀釋液中。反復(fù)凍融后，恢復(fù)室溫振蕩混勻，12 000 r/min 離心，取上清液以待檢測。

1.3.3 胎糞樣品 用棉簽取待測胎糞樣本，置于1～2 mL 樣品稀釋液中，反復(fù)凍融后，恢復(fù)至室溫振蕩混勻，12 000 r/min 離心，取上清液以待檢測。

1.4 熒光微球試紙條制備

1.4.1 熒光微球標記禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體（1）洗滌：按需量取固體含量為1%的熒光微球分散液，加入5 倍體積的硼酸鹽緩沖液（BBS，0.05 moL/L，pH8.0），以12 000 r/min 離心15 min，棄上清，重復(fù)清洗2 次；將洗滌后的熒光微球重懸于5 倍體積的BBS。（2）熒光微球活化：取50 μL 熒光微球加至1 mL 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液（MES）中，混勻，12 000 r/min 離心15 min；棄上清，加入1 mL MES 緩沖液，混勻離心；重復(fù)上述步驟3 次，并用1 mL MES 緩沖液復(fù)溶；向上述溶液中加入250 μL 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺緩沖液（EDC），混勻，室溫反應(yīng)30 min；棄上清，加入4 mL 標記緩沖液，混勻。（3）熒光微球標記：將p27 蛋白單克隆抗體2E5 加至已活化的熒光微球中，使其終質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，混勻；將混勻后含單克隆抗體2E5 的熒光微球溶液，置于室溫條件下避光反應(yīng)1.5 h；按溶液總體積3%加入封閉液（9%酪蛋白），置于室溫條件下避光反應(yīng)30 min；離心棄上清，用BBS 清洗2 次，并重懸已標記的熒光微球；以1%的體積量加入胭脂紅色素，混勻，置于2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 熒光微球墊制備 從冰箱中取出熒光微球標記p27 蛋白單克隆抗體2E5 恢復(fù)至室溫；取出玻璃纖維素膜并用輔料切條機裁切成10 cm×30 cm規(guī)格；設(shè)置噴涂量為3 μL/cm，每張玻璃纖維素膜（10 cm×30 cm）以1.0 cm 間隔噴涂8 條；將完成噴涂的玻璃纖維素膜放置于干凈紗窗網(wǎng)，（37±2）℃干燥2～3 h，逐一垂直放入輔料斬切機中切成0.7 cm×30 cm 的熒光微球墊，置于裝有干燥劑的密封袋中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 印膜制備（1）質(zhì)控線（C 線）印膜溶液：用磷酸鹽緩沖液（PB，0.05 mmoL/L，pH8.0）將禽白血病病毒p27 蛋白抗原稀釋至0.40 mg/mL，即為C 線印膜溶液；將其置于棕色玻璃瓶中，2～8 ℃保存?zhèn)溆?。?）檢測線（T 線）印膜溶液：用PB（0.05 mmoL/L，pH8.0）將p27 蛋白單克隆抗體3D5 稀釋至0.45 mg/mL，即為T 線印膜溶液；置于棕色玻璃瓶中，2～8℃保存?zhèn)溆?。?）印膜：將印膜溶液分別吸至高效連續(xù)點膜機的C 線管線和T線管線中；按0.8 μL/cm 在硝酸纖維素膜（NC 膜）上均勻劃出C 線和T 線，其中C 線距NC 膜頂端（0.8±0.1）cm 處，T 線距膜頂端（1.3±0.1）cm 處，C 線與T 線相距（0.5±0.1）cm；在膜的開始端、末端及不均勻處作標記。（4）印膜干燥：將劃線的NC 膜逐一放置在干凈紗窗網(wǎng)上，忌重疊，置于干燥間干燥，（37±2）℃干燥2 h；放入裝有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)，封口、貼上標簽，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 樣品墊制備 將玻璃纖維素膜用輔料斬切機裁切成2.0 cm×30 cm 規(guī)格，室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 檢測卡制備 在室溫及濕度≤30%RH 的潔凈環(huán)境下，按照以下步驟組裝半成品試紙。（1）貼條：依次按印膜、吸水墊、熒光微球墊、樣品墊的順序，將各中間制品粘貼于PVC 底板上，保證各中間品在相鄰處均有1 nm～2 mm 層疊，并使印膜上的T 線靠近樣品墊一側(cè)、C 線靠近吸水墊一側(cè)。（2）切條：將已組裝好的熒光微球大板修剪整齊后，用切條機裁切為（4.0±0.1）mm 的試紙。（3）裝卡：挑取印膜無劃痕、無污染、邊緣整齊的試紙，將試紙放入底卡中，蓋上卡蓋。

1.4.6 操作步驟（1）儀器準備：打開便攜式熒光免疫分析儀，選擇待檢項目，結(jié)果如需打印，同時打開藍牙打印機，并與便攜式熒光免疫分析儀連接。（2）樣品稀釋：用微量毛細采樣管取10 μL樣本加至已備好的樣本稀釋液管中混勻，稀釋后的樣品需在1 h 內(nèi)完成檢測。（3）取檢測卡：將恢復(fù)至室溫的試紙卡從鋁箔包裝中取出，放于平整、潔凈的臺面上。（4）加樣及孵育：用配套吸管吸取已稀釋好的樣本，垂直而緩慢地滴加2～3 滴（約80 μL）至加樣孔，室溫放置10～15 min。（5）儀器檢測讀數(shù)：讀數(shù)前先將產(chǎn)品配套ID 卡插入便攜式熒光免疫分析儀，再將檢測卡加樣口朝里放入便攜式熒光免疫分析儀檢測，5 min 內(nèi)完成讀值。

1.4.7 試驗成立標準 陰性：用標準陰性樣本檢測，T/C＜0.1 時，試驗成立。陽性：用禽白血病病毒p27 蛋白抗原檢測，T/C≥0.1 時，試驗成立。

1.4.8 結(jié)果判定標準 當T/C＜0.1 時，判為禽白血病病毒抗原陰性；當T/C≥0.1 時，判為禽白血病病毒抗原陽性。

1.5 質(zhì)控樣品檢驗

采用高敏熒光微球快速檢測方法以及IDEXX試劑盒，分別對30 份質(zhì)控樣品（10 份禽白血病病毒強陽性樣品、10 份弱陽性樣品、10 份陰性樣品）開展3 次重復(fù)檢測，比較2 種檢測方法對陰性樣品的檢出率。

1.6 交叉試驗

對于經(jīng)鑒定均為禽白血病病毒陰性的大腸桿菌菌體裂解液、H7N9 亞型流感病毒、H5 亞型禽流感病毒、新城疫CS2 病毒等4 份樣品，采用建立的高敏熒光微球快速檢測方法重復(fù)檢測3 次，同時用IDEXX 試劑盒開展平行檢測。

1.7 最低檢出量試驗

將禽白血病病毒在DF-1 細胞傳代擴繁，收獲細胞上清培養(yǎng)液作為陽性標準品。采用Reed-Muench 方法測算毒株在DF-1 細胞的TCID50并進行定量。將陽性標準品用稀釋液分別按1.000×103、2.000×103、4.000×103、8.000×103、1.600×104、3.200×104、6.400×104、1.280×105、2.560×105、5.120×105、1.024×106、2.048×106、4.096×106和8.192×106作梯度稀釋，制備敏感性檢驗樣品，采用建立的高敏熒光微球快速檢測方法和IDEXX 試劑盒開展檢測，測定最低檢出量。

1.8 重復(fù)性試驗

采用建立的高敏熒光微球快速檢測方法，對12 份經(jīng)鑒定的陽性樣品在同批次板和不同批次板上分別進行檢測，平行測定5 次，計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）。

1.9 符合性試驗

采用建立的高敏熒光微球快速檢測方法與IDEXX 禽白血病抗原ELISA 檢測試劑盒，檢測送檢的240 份樣品（其中陽性樣本120 份、陰性樣本120 份），計算符合率。

2 結(jié)果

2.1 p27 蛋白單克隆抗體復(fù)蘇鑒定及特異性反應(yīng)檢測

p27 蛋 白 單 克 隆 抗 體2E5 和3D5 的SDSPAGE 電泳結(jié)果（圖1）顯示，成功復(fù)蘇禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體，抗體重鏈與輕鏈大小分別為55、27 ku。經(jīng)蛋白灰度分析軟件分析，純化后的單克隆抗體純度在90%以上，滿足后續(xù)試驗需求。使用Western Blot 檢測單克隆抗體與p27、p12、p15、gp85 等蛋白的反應(yīng)特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化后的單克隆抗體只與p27 蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，與其他蛋白無交叉反應(yīng)（圖2）。

2.2 高敏熒光快速定量檢測方法建立與優(yōu)化

高敏熒光快速定量檢測方法建立后，對反應(yīng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當3D5 單抗包被質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL，鑭系熒光微球標記2E5 單抗質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，樣本稀釋比例為1:80 時，禽白血病病毒陽性與陰性樣本的P/N值最大。同時，取稀釋后的樣本80 μL 加入試劑卡加樣孔內(nèi)，避免強光照射層析15 min，然后將檢測卡放入熒光儀檢測，讀取試劑盒效價值為最佳。

圖1 禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體復(fù)蘇與鑒定結(jié)果

圖2 p27 蛋白單克隆抗體反應(yīng)特異性驗證結(jié)果

2.3 陰陽性臨界值確定

采用建立的高敏熒光快速定量檢測方法對120份陰性樣本進行檢測，測定T/C值。120 份陰性樣本T/C值X為0.095，3SD 為0.05，因此陰陽性臨界T/C值X+3SD 為0.1。將此臨界T/C值（0.1）對應(yīng)為檢測臨界值，即當試劑盒檢測值≥0.1 時，判定樣品為陽性；檢測值＜0.1 時，判定樣品為陰性。

2.4 質(zhì)控樣品檢測試驗

采用建立的高敏熒光微球快速檢測方法和IDEXX 試劑盒，分別對30 份質(zhì)控樣品開展3 次重復(fù)檢測，比較2 種檢測方法對陰性樣品的檢出率。結(jié)果顯示，高敏熒光微球快速檢測方法以及IDEXX 試劑盒對質(zhì)控陰性樣品的檢出率均為100%。

2.5 交叉試驗

對鑒定為禽白血病病毒p27 蛋白陰性的大腸桿菌菌體裂解液等4 份樣品，采用高敏熒光微球快速檢測方法開展3 次重復(fù)檢測，同時以IDEXX 試劑盒進行平行實驗，比較2 種檢測方法的交叉反應(yīng)。結(jié)果（表1）顯示，檢測結(jié)果全部為陰性，無交叉反應(yīng)。

表1 高敏熒光微球快速檢測方法交叉試驗結(jié)果

2.6 最低檢出量

將陽性標準品用稀釋液分別按照1.000×103、2.000×103等14 個梯度稀釋倍數(shù)進行稀釋，制備敏感性檢驗樣品，然后采用高敏熒光微球快速檢測方法和IDEXX 試劑盒進行檢測。結(jié)果（表2）顯示，高敏熒光微球快速檢測方法最低檢出量為1:（5.120×105），且T/C值在批間、批內(nèi)變化相對穩(wěn)定，較IDEXX 試劑盒最低檢出量[1:（2.560×105）]高，說明該檢測方法的敏感度高。

2.7 重復(fù)性試驗

采用建立的高敏熒光微球快速檢測方法，對10 份樣品在同批次板和不同批次板上分別進行檢測，平行測定5 次，計算批內(nèi)、批間發(fā)光值的變異系數(shù)（CV）。結(jié)果（表3）顯示，本試驗建立的高敏熒光微球快速檢測方法批內(nèi)發(fā)光值重復(fù)系數(shù)均小于10%，批間發(fā)光值重復(fù)系數(shù)均小于15%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

表2 高敏熒光微球快速檢測方法最低檢出量試驗結(jié)果

表3 高敏熒光微球快速檢測方法的發(fā)光值重復(fù)性試驗結(jié)果

2.8 符合性試驗

使用建立的禽白血病抗體高敏熒光微球快速檢測方法與IDEXX 檢測試劑盒，對抽取的240 份樣品（陰、陽性樣品各120 份）進行檢測比對。結(jié)果（表4）顯示，兩種方法的總符合率為93.98%，陽性符合率為90.83%，陰性符合率為95.83%。

表4 符合率統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

自20 世紀70 年代以來，歐洲國家相繼報道使用ELISA 方法檢測禽白血病[10-11]。1985 年，美國報道禽白血病病毒ELISA 抗原檢測試劑盒研發(fā)成功，并得到推廣應(yīng)用[12]。與此同時，我國也開始對禽白血病病原診斷技術(shù)進行研究。目前，國內(nèi)外對禽白血病病毒檢測技術(shù)研發(fā)主要集中于ELISA抗原檢測。我國現(xiàn)有禽白血病抗原檢測標準為國標《禽白血病診斷技術(shù)》（GB/T 26436—2010），主要涉及病原的分離鑒定、病毒核酸的分子生物學檢測以及病毒抗原ELISA 檢測方法等[7，12]?；鶎訉嶋H臨床診斷中，常根據(jù)血液學檢查和病理學特征以及結(jié)合病原和抗體檢查來確診該病。成紅細胞性白血病在外周血液、肝及骨髓涂片，可見大量的成紅細胞，肝和骨髓呈櫻桃紅色。成髓細胞性白血病在血管內(nèi)外均有成髓細胞積聚，肝呈淡紅色，骨髓呈白色。ELISA 檢測方法的穩(wěn)定性與特異性具有一定局限性。病原分離和抗體檢測是目前建立無白血病雞群的重要手段。近年來，開發(fā)靈敏度更高、檢測操作更簡單的新型禽白血病抗原診斷技術(shù)成為研究熱點。高敏快速熒光定量檢測方法是近幾年發(fā)展成熟的一種高敏感性和特異性的新檢測方法。該方法利用鑭系熒光微球作為包被介質(zhì)，充分利用鑭系元素激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、Stokes 位移大等特點，實現(xiàn)快速、敏感檢測。1979 年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini 和 Hemmila 首次提出建立稀土離子標記物的“時間分辨熒光免疫分析”理論，為高敏快速熒光定量檢測方法奠定了理論基礎(chǔ)[13-14]。1984 年，Hemmila 確 定 了DELFIA（dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay）時 間 分辨免疫分析技術(shù)方案，從而使DELFIA 成為芬蘭Wallac 公司的專利技術(shù)[15-16]。2003 年，時間分辨熒光分析技術(shù)獲我國國家科技進步二等獎。2014年萬孚生物研制心肌肌鈣蛋白I（cTnI）熒光微球試劑，在人醫(yī)領(lǐng)域獲得注冊證書[粵食藥監(jiān)械（準）字2014 第2400511 號][16]。

高敏快速熒光定量檢測方法相比較于ELISA檢測方法更敏感、特異，檢測本底值更低、信噪比更高、操作更簡便，適用于大量樣品快速檢測，更適合基層應(yīng)用。與膠體金試紙條檢測方法相比，同樣作為適用于基層使用的快速診斷檢測技術(shù)，2 種方法具有相似之處，都需要層析試紙作為檢測媒介，但是高敏快速熒光定量檢測方法具有檢測靈敏度更高、儀器判讀結(jié)果更準確等優(yōu)勢。具體來說，在標記物方面，膠體金試紙條檢測方法的標記物為膠體金，高敏快速熒光定量檢測方法的標記物為熒光微球；在檢測方法方面，膠體金試紙條使用目測方法判讀結(jié)果，高敏快速熒光定量檢測方法使用便攜式熒光檢測儀判讀檢測結(jié)果；在結(jié)果的準確性方面，高敏快速熒光定量檢測方法使用儀器判讀降低肉眼判讀誤差，且操作無需專業(yè)人員，結(jié)果相對準確，檢測時間短。因此，高敏快速熒光定量檢測方法相比較于膠體金試紙條檢測方法具有很多明顯的實驗室與基層使用優(yōu)勢。利用鑭系熒光微球開發(fā)準確、敏感、簡易、快速的禽白血病新型診斷技術(shù)，可更好地滿足禽白血病防控需求[9-11]。本試驗建立的檢測方法可使禽白血病病毒抗原檢測更快速，結(jié)果更量化、準確，從而提高該病檢驗檢疫水平，加大防疫力度，具有重要的經(jīng)濟與政治意義。

本檢測試紙采用時間分辨熒光免疫層析試驗原理制成，樣本加入到加樣孔后與熒光微球標記物一起沿層析膜移動，若樣本中存在禽白血病病毒抗原，則與熒光微球標記物及檢測線上的抗體結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號；若樣本中不存在抗原，則不產(chǎn)生熒光信號。本研究使用禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體，建立了雙抗體夾心檢測抗原的高敏熒光微球快速檢測方法。本方法敏感性高、特異性強，操作簡單、快速，適用于基層各級獸醫(yī)部門和出入境檢驗檢疫局對禽白血病病毒抗原的快速定量檢測，為禽白血病防控和凈化提供了重要技術(shù)手段。