李志田，蔡淑琳，王 合，楊海青，趙 娟，劉德文，劉 婭，張殿朋*

（1. 石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832003；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097；3. 北京市林業(yè)保護站，北京 100029；4. 北京市平谷區(qū)果品辦公室，北京101200）

關(guān) 鍵 字：桃細菌性穿孔病菌；放線菌；鑒定；活性物質(zhì)

歷年來，由桃細菌性穿孔病引發(fā)的病害對桃產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，該病害也是世界上最嚴重的植物病害之一[1,2]，其主要病原菌為Xanthomonas arboricola pv. pruni（Xap）。目前，化學(xué)防治是有效的防治方法，但存在嚴重的環(huán)境污染問題。因此，利用環(huán)境友好、生態(tài)和諧、有利食品安全的生物防治技術(shù)已成為植物病蟲害防治的新趨勢。生防微生物是生物農(nóng)藥的重要來源，其中放線菌是人們研究最早、并應(yīng)用于生產(chǎn)中的一類拮抗微生物，它可以產(chǎn)生多種抗生素、植物激素、水解酶等抑菌活性物質(zhì)，對于抑制病菌生長，提高植物抗病性具有重要作用，是頗具潛力的生物農(nóng)藥[3-5]。據(jù)統(tǒng)計，微生物產(chǎn)生具有生物活性的次級代謝物約22500余種，其中具有拮抗活性的約16500種，在這些拮抗物質(zhì)當(dāng)中有10100種（45%）產(chǎn)自于放線菌[6]。因此，對拮抗放線菌的篩選、鑒定及其活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定等研究已經(jīng)受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞，國外學(xué)者Higginbotham和Murphy[7]分離了一株抑制金黃色葡萄球菌的放線菌，經(jīng)DNA雜交顯示該菌株與渾圓鏈霉菌有80%的同源性；王聰?shù)萚8]從廣西分離一株海洋放線菌，并在次生代謝物中分離鑒定得到星型孢菌素；劉偉等[9]從一株海洋小鏈霉菌DY2741 代謝產(chǎn)物中也分離到對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用的鄰苯二甲酸二丁酯。本文通過平板對峙法從已有拮抗菌庫中篩選對桃細菌性穿孔病菌具有拮抗效果的高效放線菌菌株，從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方面確定其分類學(xué)地位，并對該菌株發(fā)酵液抑菌活性產(chǎn)物進行研究，表征其結(jié)構(gòu)，從而為新型生物農(nóng)藥的深入研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌菌株、培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株 菌株編號QH-16、XJ-39、XJ-35均由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所生物防治研究室提供，從新疆和青海的土樣中分離。指示菌株：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. niveum、草莓炭疽病菌Strawberry anthracnose、人參根腐病菌Fusarium oxysporum、禾谷鐮刀病菌Fusarium graminearum、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、桃褐腐病菌Monilinia fructicola、西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、大腸桿菌Escherichia coli、桃細菌性穿孔病菌Xanthomonas arboricola pv. pruni，以上菌株由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所生物防治研究室分離。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基[10]用于拮抗試驗，高氏一號培養(yǎng)基用于發(fā)酵培養(yǎng)[10]。生理生化特性測定所用參見《伯杰細菌鑒定手冊》[11]和《鏈霉菌鑒定手冊》[12], 放線菌形態(tài)觀察采用高氏一號培養(yǎng)基，菌種鑒定則分別采用高氏一號培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖-天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖-酵母膏瓊脂培養(yǎng)基、淀粉瓊脂培養(yǎng)基、伊莫松瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽-淀粉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨-酵母膏瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 儀器與試劑

循環(huán)制備液相LH-9100（北京佳儀分析設(shè)備有限公司），液相色譜Agilent 1200（美國Agilent 科技有限公司），分析型色譜柱為Develosil ODS-HG-5（日本野村化學(xué)），硅膠柱層析所用硅膠為200～300 目（青島海洋化工有限公司），薄層層析用分析板GF254(青島海洋化工有限公司), 制備型薄層層析用分析板PLC Silica gel 60 F254（默克化工技術(shù)有限公司）,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5000（上海振捷實驗設(shè)備有限公司），Varian核磁共振儀（美國瓦里安有限公司），液相色譜所用甲醇為色譜純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），其他試劑為化學(xué)純或分析純。

1.3 放線菌的篩選

以桃細菌性穿孔病菌（Xap）為靶標(biāo)菌，采用平板對峙法對北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所生物防治研究室菌種庫中85株放線菌菌株進行抑菌活性測定。拮抗放線菌接種于PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，將搖瓶培養(yǎng)24 h的桃細菌性穿孔病菌（Xap）菌液用無菌水稀釋5倍后均勻涂布于接有拮抗放線菌的平板上，以不接拮抗菌株為對照，28 ℃培養(yǎng)3 d。每種供試拮抗放線菌設(shè)3次重復(fù)，觀察抑菌效果。

1.4 菌株QH?16的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)特征 采用平皿插片法，將菌株QH-16接種于高氏一號培養(yǎng)基上，將滅菌的蓋玻片斜插入培養(yǎng)基中，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d，在光學(xué)顯微鏡下觀察基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的形態(tài)并拍照。

1.4.2 培養(yǎng)特征及生理特征分析 方法參考《伯杰細菌鑒定手冊》[11]和《鏈霉菌鑒定手冊》[12]。

1.4.3 菌株QH-16的16S rDNA 序列分析 用普通細菌基因組提取試劑盒提取菌株QH-16的基因組DNA后，利用 16S rDNA 的引物 243F：5′-GGATGAGCCCGCGGCCTA-3′，A3R：5′- CCAGCCCCACCTTCGAC-3′，對菌株QH-16的16S rDNA 序列進行PCR 擴增。PCR 運行程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得產(chǎn)物由北京天一輝遠生物公司進行序列測定。其余序列均下載于NCBI 網(wǎng)站，進化距離的計算采用鄰接法，用MEGA v.5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株QH?16發(fā)酵液的制備

采用500 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法。裝液量200 mL，接種量6.5%，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d后，將發(fā)酵培養(yǎng)基用快速定性濾紙抽濾，經(jīng)無菌微孔濾膜（0.22 μm）濾去菌體的上清液，備用。

1.6 菌株QH?16抑菌譜的測定

1.6.1 真菌抑菌譜的測定 在PDA平板中心接種直徑5 mm的1.1.1中供試真菌菌餅，平板邊緣用直徑5 mm打孔器打孔，取出瓊脂塞，最后分別在瓊脂孔中加入100 μL經(jīng)過濾的菌株QH-16的菌液，設(shè)置未接種菌液為空白對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察抑菌帶的情況，每個處理重復(fù)3 次。

1.6.2 細菌抑菌譜的測定 抗細菌活性檢測采用瓊脂平板打孔法。將100 μL指示細菌菌懸液均勻涂布于直徑為9 cm的PDA培養(yǎng)基平板上，然后用直徑5 mm打孔器在平板中心打孔，取出瓊脂塞，最后分別在瓊脂孔中加入100 μL經(jīng)過濾的菌株QH-16的菌液。設(shè)置未接種菌液為空白對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察結(jié)果，每個試驗重復(fù)3次。

1.7 抑菌物質(zhì)的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

1.7.1 抑菌物質(zhì)的提取 菌株QH-16發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)預(yù)處理獲得發(fā)酵液60 L，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機相經(jīng)35 ℃減壓濃縮，得到粗提物5.719 g，置于-20 ℃冰箱保存。

1.7.2 硅膠柱層析分離 采用硅膠柱進行初步分離，硅膠柱的直徑和長為2.5 cm×60 cm。裝柱體積為200 mL，干法上樣，用6種不同極性的洗脫液進行洗脫，分別是石油醚:乙酸乙酯＝10:1（V/V）440 mL，石油醚:乙酸乙酯＝5:1（V/V）360 mL，100%二氯甲烷1000 mL，二氯甲烷:甲醇＝5:1（V/V）600 mL，二氯甲烷:甲醇＝2:1（V/V）600 mL，二氯甲烷:甲醇＝1:1（V/V）600 mL，按極性順序梯度洗脫，合并得到6個組分。以瓊脂平板打孔法來確定組分的抑菌活性，組分T1具有較強的抑菌活性。

1.7.3 制備型薄層層析分離純化 硅膠柱層析獲得抑菌活性組分T1，采用制備薄層層析進一步分離純化，以石油醚:乙酸乙酯＝10:1為展開劑，將分離得到的不同組分進行抗菌活性測定，獲得的抑菌活性組分T1-1。

1.7.4 制備循環(huán)液相 用少量色譜甲醇充分溶解具有抑菌活性的樣品，0.22 μm有機微孔濾膜過濾，循環(huán)制備液相色譜進行制備。流動相為70%色譜甲醇＋30%水，檢測波長為254 nm，進樣量2.5 mL，以3.5 mL/min流速洗脫120 min。

1.7.5 抗菌活性組分的結(jié)構(gòu)鑒定 對所獲得化合物T1-1進行核磁共振（NMR），結(jié)合數(shù)據(jù)庫對所得純品進行結(jié)構(gòu)推斷。

1.8 單體物質(zhì)的抑菌活性測定

取100 μL已經(jīng)活化的桃細菌性穿孔病菌（Xap）均勻涂布于直徑為9 cm的PDA培養(yǎng)基平板上，用直徑5 mm打孔器在平板中心打孔，取出瓊脂塞，在瓊脂孔中加入60 μL用甲醇溶解的化合物，設(shè)置甲醇作為空白對照，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，每個試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌QH?16的抑菌活性及其鑒定

以桃細菌性穿孔病菌（Xap）作為指示菌，采用平板對峙培養(yǎng)法，對北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所生物防治研究室菌種庫中85株放線菌菌株進行活性篩選，共篩選出3株有明顯拮抗作用的菌株（圖1），其中菌株QH-16菌抑菌直徑最大，約為46 mm。

圖1 部分放線菌菌株對病原菌Xap的抑菌活性Fig. 1 Inhibitory activities of antagonism against pathogen Xap

2.2 菌株QH?16的鑒定

顯微觀察結(jié)果表明，菌株 QH-16在高氏一號培養(yǎng)基上，菌落生長繁茂，氣生菌絲淡粉色，基內(nèi)菌絲淺褐色，菌絲呈短直狀（圖2）。將菌株QH-16接種在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)7～14 d后，發(fā)現(xiàn)其在高氏一號、察氏、葡萄糖-天門冬素、淀粉、PDA、無機鹽-淀粉、蛋白胨-酵母膏這7種培養(yǎng)基上，菌絲生長旺盛，基內(nèi)菌絲為淺褐色、紅褐色或棕黃色（偏褐色），氣生菌絲顯現(xiàn)為淡粉色、灰白色或暗灰色；在伊莫松和葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)基上長勢一般，無可溶性色素產(chǎn)生（表1）。菌株QH-16能夠利用葡萄糖、乳糖、甘油、山梨醇、蔗糖、木糖和阿拉伯糖，無法利用鼠李糖、甘露糖、半乳糖；能夠利用牛肉膏、蛋白胨和酵母浸，無法利用硫酸銨（表2）。根據(jù)同源性從高到低的選擇原則，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。通過序列比對，放線菌QH-16與渾圓鏈霉菌S. globosus在同一系統(tǒng)進化分支上，且與渾圓鏈霉菌LZH-48相似度為99.74%。再結(jié)合培養(yǎng)特性觀察、生理試驗的驗證，結(jié)果表明菌株QH-16的培養(yǎng)特性和生理特性與渾圓鏈霉菌基本符合，因此，確定菌株QH-16為渾圓鏈霉菌。

表1 放線菌菌株QH?16的生長狀況和培養(yǎng)特征Table 1 The growth status and culture characteristics of actinomycetes QH?16

表2 放線菌菌株QH?16碳源和氮源的利用Table 2 Utilization of carbon source and nitrogen source of actinomycete strain QH?16

圖3 放線菌QH?16的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of actinomycete QH?16

2.3 菌株QH?16抑菌譜的測定

菌株QH-16在PDA平板上對部分供試的病原真菌具有抑制作用，測定其發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的抑菌帶寬達14 mm，對番茄灰霉病菌的抑菌帶寬達11 mm。采用瓊脂平板打孔法測定其發(fā)酵液對除大腸桿菌外的革蘭氏陽性菌和陰性菌都能產(chǎn)生一定的抑菌圈，對桃細菌性穿孔病菌的抑菌圈為31 mm，對西瓜嗜酸菌的抑菌圈為20 mm，對枯草芽胞桿菌的抑菌圈為22 mm（表3）?？梢?，菌株QH-16具有良好的廣譜抗菌特性。

表3 菌株QH?16抑菌活性Table 3 Inhibiting activity of QH?16

2.4 粗提物的分離純化結(jié)果

60 L發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯粗提，減壓濃縮得粗提物5.719 g油狀浸膏。分別用不同配比的洗脫液進行梯度洗脫，按照編號排列。將樣品中的物質(zhì)濃縮后，經(jīng)薄層層析板檢測，據(jù)TLC檢測紫外燈結(jié)果，合并相同斑點1～2管、3～4管、5～32管、33～37管、38～41管、42～46管，得到6個組分，分別標(biāo)記為T1、T2、T3、T4、T5、T6，通過抑菌活性檢測，T1組分有抑菌活性，T2、T3、T4、T5、T6組分無抑菌活性（表4）。T1經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量液體后，收集到樣品管中揮發(fā)至干，稱重為132.30 mg。T1經(jīng)TLC檢測，出現(xiàn)2個清晰條帶，且遷移率相差較大，采用制備薄層層析進一步純化，得到組分T1-1和T1-2。抑菌活性檢測T1-1具有抑菌活性，T1-2無抑菌活性。組分T1-1經(jīng)循環(huán)制備液相色譜制備，獲得純度較高的化合物。

表4 粗提物的硅膠柱層析結(jié)果Table 4 The result of crude extracts after silica gel column chromatography

化合物T1-1為黃色油狀物質(zhì)，其核磁共振譜氫譜1H-NMR (500MHz,CD3OD)（圖4），13C-NMR (125 MHz，CD3OD)（圖5），1H-NMR（500 MHz, CD3OD）數(shù)據(jù)（表5）中共顯示5個氫信號，δ: 7.72（2H,dd,J＝5.7,3.3 Hz, H-2,5)，7.63（2H,dd, J＝5.7,3.3 Hz, H-3,4），4.30（4H, t, J＝6.6 Hz, H-1’），1.73（4H, m, H-2’），1.47（4H, m, H-3’），0.99（6H, t,J＝7.4 Hz, H-4’）。7個 C 信號，δ: 169.27（7-COO），133.55（C-1, 6），132.32（C-3, 4），129.84（C-2, 5），66.63（C-1’），31.70（C-2’），20.25（C-3’），14.05（C-4’）。

圖4 單體化合物的1H NMR譜Fig. 4 1H NMR spectrum of purified compound

圖5 單體化合物的13C?NMR譜Fig. 5 13C?NMR spectrum of purified compound

表5 純化化合物的1H?NMR、13C?NMR數(shù)據(jù)（CD3OD, 500/125 MHz）Table 5 1H?NMR and 13C?NMR data of purified compound (CD3OD, 500/125 MHz)

經(jīng)過文獻對比，發(fā)現(xiàn)該化合物與已知化合物鄰苯二甲酸二丁酯[13]的核磁數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為鄰苯二甲酸二丁酯（圖6）。

圖6 鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 The chemical structure of DBP

2.5 分離產(chǎn)物的活性測定結(jié)果

通過用瓊脂平板打孔法測定制備產(chǎn)物T1-1的活性，制備產(chǎn)物T1-1對桃細菌性穿孔病菌表現(xiàn)抑菌作用，其中B為溶劑甲醇（圖7）。

圖7 單體物質(zhì)的抑菌活性Fig. 7 Antibacterial effect of the prepared products

3 討論

本研究采用平板對峙法篩選出一株對桃細菌性穿孔病菌具有較強拮抗作用的放線菌 QH-16，通過形態(tài)特征觀察、培養(yǎng)特性觀察、生理試驗和16S rDNA序列分析，確定菌株QH-16為渾圓鏈霉菌S. globosus。該菌株的代謝產(chǎn)物對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均表現(xiàn)出抑制作用，因此，可作為抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的優(yōu)良菌株。國內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)噬菌體[14]、熒光假單胞菌[15]、枯草芽胞桿菌[16]、無治病性的熒光假單胞菌[17]、秸稈木霉菌以及寡聚糖[18]對桃細菌性穿孔病菌具有抑制作用，但沒有桃細菌性穿孔病拮抗放線菌的相關(guān)報道。

本研究經(jīng)萃取、硅膠柱層析、制備型薄層層析板和循環(huán)制備液相色譜等步驟，從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中提取、分離純化得到化合物并初步鑒定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。最終通過NMR核對，確定活性產(chǎn)物為鄰苯二甲酸二丁酯。鄰苯二甲酸二丁酯在雷公藤[19]、海洋海藻類、山芝麻、香蕓火絨草[20]、對結(jié)白蠟樹[21]、多脂大戟[22]、三白草、紅花酢漿花、植物姜等多種植物均有發(fā)現(xiàn)，表明鄰苯二甲酸二丁酯為天然產(chǎn)物。同時，在細菌屬、放線菌屬，真菌屬均發(fā)現(xiàn)有鄰苯二甲酸二丁酯的產(chǎn)生。國內(nèi)外有很多關(guān)于鄰苯二甲酸二丁酯抑菌活性研究的報道。徐云玲等[20]在藏藥香蕓火絨草中分離純化得到17種天然產(chǎn)物，其中就有鄰苯二甲酸二丁酯，并通過實驗證明鄰苯二甲酸二丁酯對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽胞桿菌均具有抑制作用。張良菊[21]在對節(jié)白蠟樹也中發(fā)現(xiàn)了鄰苯二甲酸二丁酯，證明了其對多種真菌病原菌均具有抑制作用，其中對水稻紋枯病和小麥赤霉病具有極強的抑菌效果。馬桂珍等[23]在海洋多粘類芽胞桿菌L1-9中分離鑒定了抗菌活性物質(zhì)鄰苯二甲酸二丁酯，證明其對5種病原真菌和細菌都具有抑制作用。Roy等[24]研究表明鏈霉菌S. albidoflavus 321.2產(chǎn)生的鄰苯二甲酸二丁酯對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及釀酒酵母菌S. cerevisiae、黑曲霉Aspergill usniger、蒼白彎孢菌Curvularia pallescens 均具有較強的抑制作用。顧曉潔等[25]研究發(fā)現(xiàn)在海洋厭氧反硝化細菌Pseudomonas stutzeri (No. DN7) 也有鄰苯二甲酸二丁酯的產(chǎn)生，其對枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis和銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa具有較強抑菌活性。Ramesh和Mohanraju[26]發(fā)現(xiàn)海洋生物發(fā)光細菌對17種病原菌具有抑菌活性，其活性成分中檢測出鄰苯二甲酸二丁酯。Ahsan等[27]從鏈霉菌KX852460代謝產(chǎn)物中分離得到鄰苯二甲酸二丁酯，其對立枯絲核菌Rhizoctonia solani較強的抑制作用。但是，目前并未有在渾圓鏈霉菌代謝產(chǎn)物中分離純化得到鄰苯二甲酸二丁酯的相關(guān)報道。

本研究通過分離篩選得到抗菌活性的渾圓鏈霉菌QH-16，從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到活性產(chǎn)物鄰苯二甲酸二丁酯，但是對其藥理及毒理作用有待進一步研究。同時，渾圓鏈霉菌的代謝產(chǎn)物報道較少，今后繼續(xù)開展菌株QH-16代謝產(chǎn)物其他抗菌成分的分離、結(jié)構(gòu)鑒定以及田間試驗。