柳 滿，任 悅，高玉風(fēng)，王 芳，余 佳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)

人胚胎腎細(xì)胞系 293 (human embryonic kidney cell line，HEK293) 是一種最初來源于組織培養(yǎng)的人胚胎腎細(xì)胞的特殊細(xì)胞系。HEK293細(xì)胞是1973年在荷蘭萊頓的 Alex van der Eb 實(shí)驗(yàn)室通過將健康人胚胎腎細(xì)胞中轉(zhuǎn)化入人5型腺病毒DNA 片段培養(yǎng)轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的。這種轉(zhuǎn)化導(dǎo)致病毒基因組中大約4 500個(gè)堿基整合到人類HEK細(xì)胞的19號(hào)染色體中。這些細(xì)胞是來自于健康流產(chǎn)的胎兒，其母親的身份和流產(chǎn)的原因尚不清楚。HEK293之所以這樣命名，是因?yàn)樗?Graham 的第293次實(shí)驗(yàn)[1-2]。從細(xì)胞結(jié)構(gòu)看 HEK293細(xì)胞具有復(fù)雜的核型，每條染色體有2個(gè)或更多的拷貝，被稱為亞三倍體，染色體數(shù)目為64[3]。HEK293細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高、易于大規(guī)模培養(yǎng)、表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)接近其在體內(nèi)的構(gòu)象等特點(diǎn)。目前，HEK293細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)互作研究、藥物篩選以及重組腺病毒包裝等方面[4-6]。

翻譯是蛋白質(zhì)生物合成中的關(guān)鍵步驟，而翻譯調(diào)控對于翻譯過程來說具有重要意義。翻譯的調(diào)控是十分精密復(fù)雜的，相比于轉(zhuǎn)錄調(diào)控，翻譯調(diào)控更迅速、更高效，且可以通過對翻譯的調(diào)控進(jìn)一步控制不同蛋白的空間特異性以及彌補(bǔ)錯(cuò)誤轉(zhuǎn)錄造成的危害[7]。目前，HEK293細(xì)胞在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較廣，是大家公認(rèn)的一種工具細(xì)胞系。而對于HEK293細(xì)胞基本翻譯狀態(tài)、翻譯調(diào)控的研究及相關(guān)報(bào)道卻比較少。本文主要對HEK293細(xì)胞中翻譯調(diào)控進(jìn)行研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人胚胎腎細(xì)胞系HEK293(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基(Solarbio 公司)；胎牛血清FBS和PBS(Gibco公司)；RNase Inhibitor 和 RQ1 RNase-Free DNase(Promega 公司)；抗RPL10A抗體、抗RPL36抗體、抗RPL22抗體和抗 RPS17 抗體均(Abcam 公司)；DynabeadsTMProtein A(Thermo Fisher Scientific 公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(Beyotime 公司)；建庫及測序(Novogene 公司)。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)：將HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，鋪板至匯合度為30%左右，置于含5% CO2的37 ℃的細(xì)胞箱中培養(yǎng)。每隔 2～3 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代時(shí)先用胰蛋白酶將其消化至晃動(dòng)培養(yǎng)皿大部分細(xì)胞脫落后，立即用含有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行終止消化，隨后進(jìn)行離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)，鋪板傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Polysome profiling實(shí)驗(yàn)檢測翻譯活躍程度：用cycloheximide(100 μg/mL)處理HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)箱孵育15～30 min后收集細(xì)胞，DPBS洗2遍后液氮速凍，-80 ℃冰箱保存待用。MCB裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，在裂解過程中吹打2～3次，5 000 r/min，離心5 min。取上清液后再次進(jìn)行15 000 r/min，離心10 min。取上清液進(jìn)行上樣超速離心。SW41Ti 水平轉(zhuǎn)頭，38 000 r/min, 離心 2 h 45 min。超速離心結(jié)束后進(jìn)行蔗糖梯度分離，分離后收取核糖體各個(gè)組分并向組分中加入95%乙醇，同時(shí)加入少量糖原助沉，vortex 充分混勻，-20 ℃孵育過夜。

1.2.3 RPL10A 和 RPS17 的 RIP-seq 實(shí)驗(yàn)檢測參與翻譯過程中的mRNA：配置細(xì)胞裂解液，并用清洗液對磁珠進(jìn)行預(yù)清除，每10 cm培養(yǎng)皿細(xì)胞加入800 μL裂解液，冰上裂解30 min，每10 min用移液槍吹打1次。12 000 r/min，離心15 min，吸取上清液，留出蛋白與RNA的Input，將細(xì)胞裂解后上清液分別與RPL10A和RPS17抗體以及beads 進(jìn)行4 ℃ rotator 孵育過夜。次日用清洗液進(jìn)行清洗，取出部分作為Input，IgG，IP用作Western blot實(shí)驗(yàn)蛋白樣品，隨后 Western blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)量控制驗(yàn)證。其余部分提取 RNA，作為建庫測序樣品，并進(jìn)行 RIP-Seq 建庫測序分析。

1.2.4 RIP-Seq(RNA immunoprecipitation coupled with sequencing)建庫測序及生物信息學(xué)分析：采用新英格蘭 BioLabs(Illumina)的NEBNext Ultra RNA文庫制備試劑盒進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建，并在Illumina HiSeq X Ten平臺(tái)上機(jī)進(jìn)行雙端150測序。每組文庫重復(fù)測序2次。對原始測序數(shù)據(jù)去除接頭后，得到可用的 clean 數(shù)據(jù)，使用 fastqc 對其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。使用 Tophat2(版本2.1.1)將clean 數(shù)據(jù)比對到人類 rRNA 序列上評(píng)估建庫質(zhì)量，參數(shù)設(shè)置為-min-intron-length 20-max-multihits 1-library-type fr-unstranded。同時(shí)，使用同樣參數(shù)設(shè)置將 clean 數(shù)據(jù)比對到人類基因組(Ensembl hg38.83)。去除多重比對后，使用 htseq(版本0.12.4)計(jì)算表達(dá)量，DEseq2(版本1.18.1)計(jì)算差異基因。以 log2(fold-change)>2，P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)分別篩選IP 及 gG 特異基因，同樣以log2(IP/IgG fold-change)>2，P<0.05進(jìn)一步豐富IP組特異基因，將兩部分IP組特異基因定義為RIP靶基因。

2 結(jié)果

2.1 HEK293 細(xì)胞翻譯狀態(tài)較為活躍

Polysome profiling 結(jié)果顯示(圖1)，HEK293 細(xì)胞核糖體組分40S、60S、80S、Polysome 峰分布明顯且吸光度(absorbance，Abs) 數(shù)值較高，核糖體各組分濃度較高。Polysome 峰數(shù)目多， HEK293 細(xì)胞處于較高的翻譯活性狀態(tài)。與此同時(shí)，用核糖體大亞基蛋白 10A(ribosomal protein L10a，RPL10A)、核糖體大亞基蛋白22(ribosomal protein L22，RPL22)、核糖體大亞基蛋白36(ribosomal protein L36，RPL36) 和核糖體小亞基蛋白 17(ribosomal protein S17，RPS17) 對Polysome profiling實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)RPL10A、RPL22和RPL36主要分布于核糖體組分60S、80S和多聚峰，RPS17主要分布于核糖體組分40S、80S和多聚峰。根據(jù)其核糖體蛋白準(zhǔn)確分布情況，可以證明其實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

Polysome profiling was used to detect translational activity of HEK293 cells, Western blot was used to verify the distribution of ribosomal proteins圖1 HEK293 細(xì)胞的翻譯活性的檢測Fig 1 Detection of translational activity of HEK293 cells

2.2 RPL10A 的 RIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RPL10A抗體可以特異性富集細(xì)胞內(nèi)源性RPL10A蛋白(圖2A)。接下來對富集到的RNA進(jìn)行建庫測序分析(圖2B)。根據(jù)測序結(jié)果顯示，RPL10A共富集577 個(gè)特異性基因，其 IP特有占90.9%，IP和IgG共有占1.6%。同時(shí)對富集到的特異性基因進(jìn)行了基因類型注釋(圖2C)?；蝾愋椭饕獮榈鞍踪|(zhì)編碼基因占比83.2%、轉(zhuǎn)錄未加工假基因占比4.3%、反義 RNA 占比4.2%、長鏈非編碼 RNA 占比3.8%。

A.protein expression of RPL10A detected by Western blot；B.Venn diagram of immunoprecipitated RNAs with RPL10A and IgG；C.gene types of specific immunoprecipitated RNAs with RPL10A圖2 RPL10A 的 RIP-seq 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Fig 2 Analysis of RIP-seq for RPL10A

2.3 RPS17 的 RIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RPS17 抗體可以特異性富集細(xì)胞內(nèi)源性RPS17蛋白(圖3A)。接下來對富集到的RNA進(jìn)行RIP-Seq建庫測序分析(圖3B)。根據(jù)測序結(jié)果顯示，RPL10A抗體共富集740 個(gè)基因，其中 IP 特有占 52.8%，IP和IgG共有占24.1%。同時(shí)對富集到的特異性基因進(jìn)行了基因類型注釋(圖3C)?；蝾愋椭饕獮榈鞍踪|(zhì)編碼基因占比90.8%、長鏈非編碼RNA占比3.0%、反義 RNA 占比1.9%、轉(zhuǎn)錄未加工假基因占比1.5%。

A.potein expression of RPS17 determined by Western blot；B.Venn diagram of immunoprecipitated RNAs with RPS17 and IgG；C.gene types of specific immunoprecipitated RNAs with RPS17圖3 RPS17的RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Fig 3 Analysis of RIP for RPS17

2.4 RPL10A和RPS17 RIP-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分析

在 RPL10A和RPS17的RIP-seq 實(shí)驗(yàn)富集到的基因比較分析中發(fā)現(xiàn)共有 129 個(gè)基因(圖4A)，其中93.8% 為蛋白編碼基因(圖4B)。與此同時(shí)，對這 129 個(gè)基因進(jìn)行了功能富集分析(圖4C)，發(fā)現(xiàn)涉及到 RNA 剪接、分解代謝過程的負(fù)調(diào)控、應(yīng)激激活的絲裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、對含砷物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對未折疊蛋白的反應(yīng)、蛋白質(zhì)染色體定位、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)等。其中 RNA 剪接最為顯著，其包含的基因有氯核苷酸敏感通道 1A基因(chloride nucleotide-sensitive channel 1A，CLNS1A)、白細(xì)胞介素細(xì)胞因子基因(cytokine，IK)、核仁蛋白基因(nucleolin，NCL)、橋粒相關(guān)蛋白基因(pinin，PNN)、CCCH 型鋅指 2基因(zinc finger CCCH-type，ZRSR2)、mRNA 前體加工因子 3基因(pre-mRNA processing factor 3，PRPF3)、甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白 3基因(thyroid hormone receptor associated protein 3，THRAP3)、RNA結(jié)合基序蛋白6基因(RNA binding motif protein 6，RBM6)、 絲氨酸/精氨酸相關(guān)核基質(zhì)蛋白 1基因(serine and arginine repetitive matrix 1，SRRM1)、人體免疫缺陷病毒1 型反式激活蛋白特異性因子1基因(HIV-1 Tat specific factor 1，HTATSF1)、G蛋白修補(bǔ)結(jié)構(gòu)域蛋白 1基因(G-patch domain containing 1，GPATCH1)、核旁斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)蛋白1基因(paraspeckle component 1，PSPC1)、細(xì)胞分裂周期與凋亡調(diào)控因子1基因(cell division cycle and apoptosis regulator 1，CCAR1)等(表1)。

A.Venn diagram of specific immunoprecipitated RNAs with RPL10A and RPS17；B.gene types of shared immunoprecipitated RNAs with RPL10A and RPS17；C.gene ontology enrichment of 129 shared RNAs圖4 RPL10A和RPS17的RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Fig 4 Analysis of RIP between RPL10A and RPS17

表1 功能富集分析中的 RNA 剪接相關(guān)條目Table 1 RNA splicing in gene ontology enrichment analysis

3 討論

本文通過對 HEK293 細(xì)胞進(jìn)行翻譯調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)，通過測序分析獲得的 RPL10A 和 RPS17 數(shù)據(jù)結(jié)果交集部分不大，主要考慮以下幾點(diǎn)原因：第一，抗體的特異性。每一種抗體都存在特異性的問題，不同的抗體特異性的差異會(huì)很大，難以避免在實(shí)驗(yàn)過程中獲得的分子類型以及數(shù)目的差異。第二,不同的核糖體蛋白在翻譯的過程中所處的空間位置的差異[8]。RPL10A位于核糖體的大亞基，而RPS17位于的小亞基，不同的空間位阻決定了不同的IP效率。綜合以上兩點(diǎn)原因分析，可以進(jìn)一步理解為什么本文在兩種不同核糖體蛋白的情況下僅有129個(gè)共同基因，但通過對這129個(gè)共同基因的進(jìn)一步分析中發(fā)現(xiàn)，這些基因中有93.8%為蛋白編碼基因，說明實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。對共同富集的 129 個(gè)基因進(jìn)行了基因功能富集分析，結(jié)果表明RNA剪接最為顯著，說明RNA剪接基因在HEK293細(xì)胞的翻譯過程中較為活躍。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中活躍翻譯基因的主要功能為RNA剪接。