周 鴻，鄧 健，楊 鋒，余 杰，胡林旺*

(湖南省人民醫(yī)院 1.神經(jīng)外二科，2.藥學(xué)二部，湖南 長沙 410002)

突觸間隙內(nèi)谷氨酸的過量蓄積導(dǎo)致的興奮性毒性是缺血性腦損傷(ischemic brain injury，IBI)的重要機(jī)制之一，并且是神經(jīng)二次損傷和病后轉(zhuǎn)歸主要的不良因素[1]。膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glial glutamate transporter 1，GLT-1)承擔(dān)了約90%的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)，且80%以上的GLT-1表達(dá)于海馬[2]。海馬CA1區(qū)對缺氧缺血最為敏感，且海馬CA1區(qū)錐體層神經(jīng)元損傷會導(dǎo)致認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，直接導(dǎo)致IBI患者的不良預(yù)后[3]。因此，研究海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)與功能對研究IBI后的興奮性谷氨酸毒性反應(yīng)至關(guān)重要。

在IBI患者腦脊液中食欲素A(orexin-A，OX-A)含量降低，且OX-A低含量與IBI嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4]。側(cè)腦室注射OX-A能降低腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的腦梗死體積[5]。以上現(xiàn)象提示：OX-A可能具有抗IBI的效應(yīng)。而OX-A對短暫性全腦缺血(transient global cerebral ischemia，tGCI)中GLT-1的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性以及對谷氨酸攝取能力仍不清楚，因此本研究觀察側(cè)腦室注射OX-A對tGCI大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)與功能的影響，并分析其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

30只7周齡SPF級雄性SD大鼠[長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，SCXK(湘)2019-0014]；OX-A試劑和LY294002[phosphotidylinsitol-3-kinase(PI3K)抑制劑]試劑(MedChemExpress公司)；谷氨酸定量試劑盒和硫堇溶液(北京索萊寶生物科技有限公司)；Fluro-Jade C(FJ-C)染色試劑盒(Chemicon公司)；膜蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；[3H]-glutamate試劑(PerkinElmer公司)；DHK試劑(Sigma-Aldrich公司)；NeuN、GLP-1、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT抗體(Cell Signaling Technology公司)；BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組(n=6)和tGCI造模組(n=24)。采用改良四血管閉塞法對大鼠進(jìn)行tGCI造模，缺血10 min后，恢復(fù)血液灌流[6]。將18只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型(model)組、OX-A組(造模后1 d，側(cè)腦室注射給藥30 μg/kg OX-A)和OX-A+LY294002組(100 μg/kg LY294002)3個亞組，每個亞組納入6只大鼠。側(cè)腦室微量注射儀進(jìn)針位置為前鹵后0.8 mm，向右1.5 mm，深度3.8 mm，注射速度為1 μL/min，注射后留針8 min。注射后2 d進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 腦海馬CA1區(qū)組織樣本收集：麻醉大鼠后，斷頭取腦，分離腦組織留存，然后通過解剖顯微鏡分離出海馬CA1區(qū)組織。

1.2.3 Western blot檢測GLP-1、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)：用RIPA試劑分離各組海馬CA1區(qū)組織的總蛋白，用常規(guī)Western blot孵育GLP-1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH抗體。并在曝光顯影后，用Image J軟件定量各樣本目的條帶的吸光度值。

1.2.4 [3H]-glutamate放射性配基-受體結(jié)合實驗檢測海馬CA1區(qū)GLT-1的結(jié)合能力和對谷氨酸的攝取能力：用膜蛋白提取試劑盒分離各組海馬CA1區(qū)組織的膜蛋白，并用BCA法對膜蛋白定量后，分別取50 μg膜蛋白、[3H]-glutamate試劑和DHK試劑用于制作總結(jié)合管和非特異性管，并在37 ℃下孵育各管30 min后，將一部分反應(yīng)液用GF/C玻璃纖維濾膜抽濾并用Hepes緩沖液沖洗濾膜2次；將另一部分反應(yīng)液加入NaOH溶液(0.3 mol/L)中并室溫反應(yīng)20 min后，將所得混合溶液滴入GF/C玻璃纖維濾膜中。將上述所有濾膜烘干后，加入2 mL閃爍液并避光孵育過夜，用液體閃爍儀測定放射強(qiáng)度，然后根據(jù)scatchard反應(yīng)曲線計算GLT-1的最大結(jié)合量(maximum binding capacity，Bmax)、解離常數(shù)(dissociation constant，Kd)和谷氨酸攝取量。

1.2.5 海馬CA1區(qū)神經(jīng)組織中谷氨酸含量的測定：按谷氨酸定量試劑盒步驟，各組分別取0.1 g海馬CA1區(qū)組織，用組織裂解液在冰上勻漿，收集勻漿液，并用BCA法進(jìn)行膜蛋白定量；將勻漿液和反應(yīng)液混合后，用紫外分光光度計分別記錄波長340 nm處反應(yīng)20 s和5 min 20 s時的吸光度值A(chǔ)1和A2，計算A2-A1值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算谷氨酸含量(mmol/L)，最后根據(jù)蛋白含量換算單位mg蛋白中谷氨酸含量。

1.2.6 尼氏(Nissol)染色檢測尼氏體：取各組腦組織，用石蠟包埋，并切為5 μm厚腦片。腦片經(jīng)脫蠟和再水化后，用0.1%硫堇溶液常溫染色30 min，然后用顯微鏡觀察并拍照，并在200×鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm×1 mm區(qū)域內(nèi)尼氏體數(shù)量。

1.2.7 FJ-C(Fluro-Jade C)染色檢測退化神經(jīng)元：取各組脫蠟至水后的腦片(30 μm厚)，依次經(jīng)1% NaOH/80%乙醇溶液和0.06%高錳酸鉀溶液浸泡后，用0.01% FJ-C溶液室溫避光孵育45 min，然后用熒光顯微鏡觀察并拍照，并在200×鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm×1 mm區(qū)域內(nèi)FJ-C陽性染色細(xì)胞數(shù)量。

1.2.8 NeuN免疫組化染色檢測神經(jīng)元：取各組脫蠟至水后的腦片(5 μm厚)，用常規(guī)免疫組化法孵育NeuN抗體，并在DAB顯色后，用顯微鏡觀察并拍照，并在200×鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm×1 mm區(qū)域內(nèi)NeuN陽性染色細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)PI3K/AKT信號活性的變化

與假手術(shù)組比較，模型組海馬CA1區(qū)PI3K/AKT信號活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，OX-A能完全逆轉(zhuǎn)tGCI造成的海馬CA1區(qū)PI3K/AKT信號活性滅活(P<0.05)；而相對OX-A組，PI3K/AKT信號抑制劑LY294002能抑制OX-A對PI3K/AKT信號增強(qiáng)效應(yīng)(P<0.05)(圖1)。

A,B.expressions of p-PI3K; C, D. the expressions of p-AKT; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with OX-A group圖1 海馬CA1區(qū)PI3K/AKT信號活性的變化Fig 1 Changes of PI3K/AKT signal activity in hippocampal CA1 n=6)

2.2 海馬CA1區(qū)GLP-1表達(dá)與功能的變化

與假手術(shù)組比較，模型組海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)、Bmax值和谷氨酸濃度明顯增加(P<0.05)，Kd值和谷氨酸攝取量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，OX-A能完全或部分逆轉(zhuǎn)tGCI造成的海馬CA1區(qū)的上述指標(biāo)變化(P<0.05)；而相對OX-A組，LY294002能抑制OX-A對tGCI的效應(yīng)(P<0.05)(圖2，表1)。

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with OX-A group圖2 海馬CA1區(qū)GLP-1蛋白表達(dá)的變化Fig 2 Changes of GLP-1 protein expression in hippo

表1 海馬CA1區(qū)GLP-1功能的變化Table 1 Changes of GLP-1 function in hippocampal CA1 n=6)

2.3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的病理學(xué)改變

與假手術(shù)組比較，模型組海馬CA1區(qū)尼氏體和NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)J-C陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，OX-A能增加海馬CA1區(qū)尼氏體和NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)量并降低FJ-C陽性神經(jīng)元數(shù)量(P<0.05)；而相對OX-A組，LY294002能抑制OX-A對tGCI的效應(yīng)(P<0.05)(圖3,表2)。

表2 海馬CA1區(qū)尼氏體、NeuN陽性細(xì)胞和FJ-C陽性細(xì)胞的密度Table 2 Density of Nissl body, NeuN positive cell and FJ-C positive cell in hippocampal CA1

圖3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的病理學(xué)改變Fig 3 Pathological changes of hippocampal CA1 neurons (scale bar=50 μm)

3 討論

IBI是造成全球人類的第一大致殘和第三大致死的重要病因[7]，但目前IBI的治療效果并不太理想[8]。因此，尋找更多有效的IBI治療策略頗為緊迫。

OX-A具有減輕IBI的作用[5,9]，但具體機(jī)制尚不完全清楚。興奮性谷氨酸的神經(jīng)毒性是IBI的重要機(jī)制之一[1]。IBI后，海馬CA1區(qū)細(xì)胞外谷氨酸的清除主要依賴GLT-1將細(xì)胞外谷氨酸攝取到膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)[2]。在大鼠tGCI模型中，在海馬CA1錐體層發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuronal death，DND)之前，就觀測到CA1星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白電流的最大幅度的降低[10]，本研究同樣觀測到在tGCI大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)降低和DND。在缺氧環(huán)境下，OX-A能通過增加GLT-1的表達(dá)促進(jìn)體外膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取能力[11]，這可能是OX-A抗IBI的機(jī)制之一。而OX-A對大鼠tGCI模型中海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)和功能的影響尚不清楚，本研究結(jié)果顯示，OX-A能增加海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)和最大結(jié)合量，并促進(jìn)GLT-1對谷氨酸的親和力和攝取能力，減少了興奮性谷氨酸在細(xì)胞外水平，最終減少了DND。

在糖氧剝奪條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞的PI3K/AKT信號活性降低；而增強(qiáng)PI3K/Akt信號活性可上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的表達(dá)并增強(qiáng)其攝取細(xì)胞外谷氨酸的能力[12]，這一結(jié)果提示GLT-1的表達(dá)受到PI3K/AKT信號活性調(diào)節(jié)。OX-A降低MCAO大鼠的腦梗死體積的作用與其激活PI3K/AKT信號活性相關(guān)[5]。本研究結(jié)果顯示，大鼠tGCI后海馬CA1區(qū)PI3K/AKT活性降低和GLP-1表達(dá)、結(jié)合與攝取功能下降相一致；給予OX-A治療后PI3K/AKT活性增強(qiáng)和GLP-1表達(dá)、結(jié)合與攝取功能增高相一致，這一結(jié)果說明，在大鼠tGCI模型中，OX-A對GLP-1表達(dá)與功能的促進(jìn)作用與其上調(diào)PI3K/AKT活性相關(guān)。此外，本研究還通過側(cè)腦室注射PI3K/AKT抑制劑LY294002的方法進(jìn)一步證實了OX-A通過上調(diào)PI3K/AKT活性來發(fā)揮促進(jìn)GLP-1表達(dá)、結(jié)合與攝取谷氨酸功能以及減輕DND的作用。

綜上所述，外源性O(shè)X-A可通過上調(diào)PI3K/AKT信號活性來增加tGCI大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)、增強(qiáng)與GLP-1結(jié)合和攝取谷氨酸的功能并減輕興奮性谷氨酸導(dǎo)致的DND。