郝文真，陳杰民，馮云路，吳 晰，王 強(qiáng)，吳 東，楊愛明

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 疑難重癥及罕見病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 消化內(nèi)科，北京 100730)

胰腺癌(pancreatic caner)的治療效果差、病死率高，預(yù)計(jì)到2030年，它將成為繼肺癌之后第二大癌相關(guān)死亡原因[1]。由于早期缺乏特異臨床癥狀和合適的診斷方法，只有20%胰腺癌在進(jìn)行相關(guān)檢查時(shí)得以診斷[2]。胰腺癌治療的耐藥性也是難以解決的問題[3]。因此，探索胰腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為尋找胰腺癌早期診斷和治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)非常重要。可變剪接在生理過程中發(fā)揮重要作用，剪接失調(diào)是腫瘤發(fā)生的特征之一。肌盲樣蛋白(muscleblind-like proteins，MBNL)是一種RNA結(jié)合蛋白，可雙向調(diào)節(jié)剪接過程[4]，在癌組織中過表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[5]。本研究擬探討MBNL3在胰腺癌組織中表達(dá)情況，同時(shí)利用體外培養(yǎng)技術(shù)敲低或過表達(dá)胰腺癌細(xì)胞系中的MBNL3基因，觀察癌細(xì)胞生物學(xué)行為和功能的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源：納入2017年至2020年于北京協(xié)和醫(yī)院行胰腺癌切除的50例胰腺癌患者，獲取胰腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁胰腺組織(距離腫瘤病灶邊緣>5 cm)石蠟樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤局限于胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)，無胰腺外侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后病理明確診斷為胰腺癌；術(shù)前未接受過放射治療和(或)化學(xué)治療；排除胰腺細(xì)胞不典型增生患者。該研究通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)并豁免知情同意書(倫理審查批件編號(hào)：ZS-2698)。

1.1.2 細(xì)胞系及主要試劑：人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE、人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC1、BXPC3、CFPAC1和SW1990(中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫)；RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào)21870076)、胰蛋白酶(貨號(hào):15050065)、胎牛血清(貨號(hào):10099141)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒(貨號(hào):23227)、細(xì)胞裂解液(貨號(hào):89900)(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白酶抑制劑(貨號(hào):ab65621)、兔抗人MBNL3抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；Neofect DNA轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào):TF201201)(北京瑪因科技有限公司)；免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)試劑盒(貨號(hào):GK500705)(Dako公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)法：按照試劑盒說明書操作，微波熱修復(fù)抗原10 min后等待溫度自然降至室溫，DAB顯色90 s。每張切片免疫組化結(jié)果均由2位病理科醫(yī)師雙盲評(píng)價(jià)。根據(jù)免疫組化染色著色強(qiáng)度和范圍綜合評(píng)價(jià)：1)細(xì)胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；2)無陽性細(xì)胞為0分，陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)百分比<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。將這兩項(xiàng)評(píng)分的乘積作為最終評(píng)分，包括0、1、2、3、4、6、9分。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)：當(dāng)胰腺癌細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液(1∶200)，充分裂解后，BCA試劑盒定量變性。蛋白行10% SDS-PAGE。轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉過夜。一抗4 ℃搖床孵育8 h，二抗室溫孵育1 h。PBST洗滌后暗室顯影，用Image J軟件灰度分析蛋白條帶。

1.2.3 載體構(gòu)建與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：質(zhì)粒構(gòu)建與測序鑒定由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。以pcDNA3.1質(zhì)粒為骨架，攜帶啟動(dòng)子、新霉素抗性基因、氨芐霉素抗性基因，在HindⅢ和BamHⅠ兩處酶切位點(diǎn)剪切后插入人MBNL3基因，構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒CMV-HindⅢ-MBNL3-Flag-BamHⅠ和敲低質(zhì)粒CMV-HindⅢ-shRNA1-MBNL3-BamHⅠ及CMV-HindⅢ-shRNA2-MBNL3-BamHⅠ。采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在MBNL3表達(dá)水平較高的胰腺癌野生型細(xì)胞系A(chǔ)SPC1和SW1990中選擇兩個(gè)位點(diǎn)敲低MBNL3基因表達(dá)，在MBNL3表達(dá)水平較低的胰腺癌野生型細(xì)胞系BXPC3和CFPAC1中過表達(dá)MBNL3基因。采用Neofact轉(zhuǎn)染法按照說明書配制體系，將shRNA-control、shRNA1-MBNL3、shRNA2-MBNL3、pcDNA3.1-Flag和MBNL3-Flag分別轉(zhuǎn)染至上述4種胰腺癌細(xì)胞系中。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：E-Plate檢測板使用前用紫外線照射過夜并調(diào)零。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞計(jì)數(shù)以3 000個(gè)/孔接種于E-Plate檢測板，實(shí)時(shí)無標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)(real-time cellular analysis,RTCA)法觀察比較各組細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 平板集落形成實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔1 000個(gè)/3 mL接種于6孔板。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)10 d后，甲醇固定，結(jié)晶紫染色。拍照保存并計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞集落形成數(shù)目。

1.2.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲：在Transwell小室濾膜上鋪2%基質(zhì)膠100 μL，用于侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室濾膜不鋪膠。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，用無血清培養(yǎng)基重懸配制成6×105/mL細(xì)胞懸液。下室加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基800 μL，上室加細(xì)胞懸液100 μL。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)10 h后，甲醇固定，結(jié)晶紫染色。普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MBNL3蛋白在胰腺癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)

在正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE和4種胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC1、BXPC3、CFPAC1、SW1990中，正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE中無表達(dá)，胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC1和SW1990中的表達(dá)量高于BXPC3和CFPAC1(圖1A)。

MBNL3蛋白在胰腺癌組織著色強(qiáng)度和著色范圍評(píng)分分別為2.8±0.3和2.5±0.6，均顯著高于其所對(duì)應(yīng)癌旁組織的1.1±0.6和1.0±0.6(P<0.05)；50例胰腺癌組織中，MBNL3的免疫組化染色評(píng)分為5.0±2.7，顯著低于癌旁組織的2.1±0.6(P<0.05)(圖1B)。

A.protein expression of MBNL3 in pancreatic normal or cancer cell lines; B.protein expression of MBNL3 in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues(×20); *P<0.05 compared with adjacent tissue group圖1 MBNL3在正常胰腺上皮細(xì)胞系和胰腺癌細(xì)胞系、組織中的表達(dá)Fig 1 Protein expression of MBNL3 in pancreatic normal or cancer cell lines and pancreatic cancer n=3)

2.2 MBNL3對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與集落形成的影響

2.2.1 轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞系MBNL3蛋白表達(dá)：蛋白印跡法結(jié)果顯示，與野生型細(xì)胞相比，敲低的ASPC1和SW1990細(xì)胞中MBNL3蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，而過表達(dá)的BXPC3和CFPAC1細(xì)胞中MBNL3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2A)。

2.2.2 對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響：與對(duì)照組相比，72 h內(nèi)過表達(dá)組的胰腺癌細(xì)胞增殖曲線高于對(duì)照組，而敲低組的胰腺癌細(xì)胞增殖曲線低于對(duì)照組(圖2B)。

A.protein expression of MBNL3 in transfected pancreatic cancer cell lines; B.effects of MBNL3 on proliferation of pancreatic cancer cell lines; *P<0.05 compared with control group圖2 轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞系MBNL3表達(dá)與增殖Fig 2 Expression of MBNL3 and cell proliferation in transfected pancreatic cancer cell n=3)

2.2.3 對(duì)胰腺癌細(xì)胞集落形成能力的影響：轉(zhuǎn)染10 d后，過表達(dá)組的胰腺癌細(xì)胞集落形成體積大，集落數(shù)目多(P<0.05)；而敲低組的胰腺癌細(xì)胞集落形成體積小，集落數(shù)目少(P<0.05)(圖3A)。

2.2.4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響：與對(duì)照組相比，過表達(dá)組的胰腺癌細(xì)胞穿過Transwell小室膜的數(shù)量更多(P<0.05)；而敲低組的胰腺癌細(xì)胞穿過Transwell小室膜的數(shù)量更少(P<0.05)(圖3B,C)。

A.images of MBNL3 knocked down or over-expressed on colony formation of pancreatic cancer cell lines; B.effects of MBNL3 knocked down or over-expressed on migration capacity of pancreatic cancer cells by Transwell assay(×20); C.effects of MBNL3 knocked down or over-expressed on invasion capacity of ASPC1 pancreatic cancer cells by Transwell assay(×20); *P<0.05 compared with control group圖3 轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞系集落形成、遷移和侵襲Fig 3 Colony farming, migration and invasion of transfected pancreatic cancer cell n=3)

2.2.5 繪制ROC曲線:根據(jù)MBNL3在胰腺癌組織中表達(dá)的免疫組化染色總分來繪制ROC曲線，結(jié)果提示，以免疫組化總分為預(yù)測指標(biāo)，當(dāng)?shù)梅譃?時(shí)，曲線下面積最大為0.88，約登指數(shù)為0.56(圖4)。

圖4 基于MBNL3在胰腺癌組織中免疫組化得分的ROC曲線Fig 4 ROC curve based on Immunohistochemistry Score of MBNL3 in pancreatic cancer tissue

3 討論

MBNL3通過直接或參與調(diào)節(jié)可變剪接的蛋白質(zhì)，如替代外顯子編碼序列[6]、鋅指結(jié)構(gòu)[7]、富蛋白元素[8]、下游富含谷氨酰胺區(qū)域[9]等調(diào)節(jié)可變剪接過程，對(duì)組織胚胎發(fā)育至關(guān)重要，表達(dá)異常會(huì)引起疾病[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MBNL3過表達(dá)可能與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。MBNL3對(duì)癌細(xì)胞的促進(jìn)作用在肝細(xì)胞肝癌中也有報(bào)道[11]。TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，MBNL3表達(dá)水平在胰腺癌與正常胰腺組織存在差異，分化差的胰腺癌中其表達(dá)水平更高。本研究的MBNL3免疫組化胰腺癌ROC曲線提示，當(dāng)?shù)梅譃?時(shí)，區(qū)別胰腺癌組織與癌旁胰腺組織能力最優(yōu)，得分高于3時(shí)診斷傾向于胰腺癌。有研究對(duì)683例胰腺癌血清CEA和CA12-5分析并制作ROC曲線，二者區(qū)別胰腺癌的曲線下面積分別為0.89和0.85[12]。另外，數(shù)據(jù)庫分析顯示MBNL3過表達(dá)對(duì)患者無病生存期和總生存期有影響，提示MBNL3有可能作為胰腺癌診斷和預(yù)后的潛在生物分子標(biāo)志物。

本研究納入的胰腺癌臨床病理樣本不伴周圍侵襲、沒有淋巴結(jié)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)MBNL3蛋白表達(dá)水平與胰腺癌惡性生物學(xué)行為有密切關(guān)系，初步表明MBNL3有可能作為胰腺癌早期診斷或生物治療的分子標(biāo)志物。本研究的不足之處是納入樣本較少，仍需要大批量組織樣本進(jìn)行驗(yàn)證。有望通過血清學(xué)檢測來探究MBNL3在早期診斷和預(yù)后檢測中的診斷效能和應(yīng)用價(jià)值。

總之，本研究初步揭示了MBNL3在促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。有關(guān)MBNL蛋白家族的研究對(duì)尋找胰腺癌早期診斷和生物治療提供新的分子靶標(biāo)具有重要意義。