顧宗廷,李宗澤,王成鋒

顧宗廷,李宗澤,王成鋒,國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室/胰胃外科 北京市 100021

0 前言

胰腺癌是目前人類預后最差的實體惡性腫瘤,其中約90%是胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC).在中國,PDAC的5年生存率僅為7.2%,且無明顯改善趨勢[1].盡管手術切除是唯一可能治愈PDAC的手段,但術后5年生存率也僅為10%-25%,且有手術指征的患者僅占15%-20%[2].因此,化療仍是PDAC最重要的治療選擇之一.改良FOLFIRINOX方案(奧沙利鉑、伊立替康、5-FU和亞葉酸鈣)對PDAC的療效已證實優(yōu)于吉西他濱(gemcitabine,GEM),但更高的毒性作用發(fā)生率限制了其應用[3].因此,GEM仍是目前PDAC化療的基石.GEM是一種脫氧胞苷核苷類似物,可作為競爭性底物摻入DNA鏈并終止其復制,最終導致細胞死亡[4].然而,GEM單藥治療晚期PDAC的中位無進展生存期僅為3.7個月[5],GEM耐藥是其中的關鍵原因.與其他惡性腫瘤相比,廣泛而致密的纖維間質是PDAC的重要特征,PDAC細胞周圍的增生結締組織約占腫瘤總體積的90%,嚴重扭曲了正常的胰腺結構[6].增生結締組織主要由間質細胞成分、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)、血管和淋巴管組成,共同構建成腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)(圖1).PDAC細胞與TME之間的相互作用是刺激廣泛纖維增生的主要原因[7].TME不僅是PDAC生長、擴散的積極參與者,更是誘導GEM耐藥的貢獻者[8].TME通過ECM的物理屏障作用和改變細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinases,Akt)、轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)等通路活化狀態(tài),影響PDAC細胞中相關基因的表達,誘導GEM抵抗[9].因此,PDAC細胞外途徑并非孤立事件,而是與PDAC細胞共同促進GEM耐藥的發(fā)生.本文將重點從PDAC細胞外途徑討論GEM化療耐藥的主要細胞和分子機制研究進展(表1).細胞外TME各組分與PDAC細胞間相互作用機制的進一步研究,有助于發(fā)現(xiàn)GEM耐藥的潛在治療靶點,為化療增敏和改善PDAC總體預后提供新的策略.

1 GEM與乏氧

纖維結締組織增生和供血血管減少削弱了PDAC的組織灌注,造成了乏氧的TME[10](圖1).低氧通過缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)介導上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、糖酵解通路的活化,導致GEM耐藥[11,12].體外試驗亦證實,下調HIF-1α可增加GEM的敏感性[11,13].另外,低氧也可通過Akt/Notch1信號通路增強GEM誘導的細胞干性并促進化療抵抗[14].因此,缺氧賦予腫瘤組織對GEM的抵抗力.但遺憾的是,一項關于GEM聯(lián)合靶向低氧TME的細胞毒性藥(TH-302)治療晚期PDAC的Ⅲ期臨床試驗(NCT01746979)結果并未顯示出總生存期(overall survival,OS)的統(tǒng)計學差異[15].PDAC自身及所屬TME的異質性增加了缺氧誘發(fā)GEM耐藥機制的復雜性,這可能是臨床試驗失敗的原因之一.酸中毒是TME的另一重要特征.HIF-1α介導的糖酵解乳酸生成和碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)介導的碳酸生成,是PDAC細胞外H+的主要來源[16].一項最新的研究顯示,缺氧誘導HIF-1α通過上調CA9的表達,介導PDAC糖酵解增加和細胞內、外pH的變化,增加GEM抵抗.相反,沉默或抑制CA9則可逆轉這一過程[17].此外,酸性TME也可能通過誘導EMT介導GEM抵抗[18].因此,靶向改變細胞外pH值有望成為GEM增敏的新策略.另外,TME應激也參與了細胞代謝的重塑,但其代謝影響與GEM耐藥的直接關系仍待進一步明確[19].

2 GEM與ECM

PDAC的TME中存在大量致密的基質成分(圖1),一方面致密的纖維組織壓迫腫瘤組織內的血管,阻止GEM進入組織,另一方面基質成分與PDAC細胞間相互作用,共同促進了GEM耐藥.

2.1 膠原蛋白 PDAC的基質主要由I型膠原蛋白組成,其正常亞型是一種可被膠原酶降解的異型三聚體,但PDAC細胞可分泌特有的同型三聚體,后者對所有膠原溶解性基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)均具有抗性[20].臨床前研究證實,基質膠原蛋白可形成物理屏障影響GEM滲透和治療反應[8].此外,膠原蛋白通過上調PDAC中膜型1-基質金屬蛋白酶(membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)的表達,增加ERK1/2磷酸化,并進一步上調高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)的表達[21].HMGA2是DNA堿基末端連接修復機制的一部分,可從DNA中去除小的受損堿基,并具有嘌呤/嘧啶裂解酶活性,可削弱GEM在富含膠原的TME中的作用[22].另外,HMGA2過表達還促進PDAC細胞組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases,HATs)上調,增加組蛋白H3K9和H3K27乙?；?促進染色質松弛和最終的DNA修復,介導GEM抗性[23].由此可見,靶向MT1-MMP/HMGA2/HATs信號通路可能是新的GEM增敏策略.遺憾的是,針對MMPs廣譜抑制劑的所有臨床試驗,與單獨使用GEM相比均未顯示臨床優(yōu)勢,缺乏選擇性地MMPs抑制劑一度被認為是試驗失敗的原因之一[24].但有趣的是,一項最新的研究顯示,MMP1組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)可通過激活PI3K/Akt促生存信號通路參與GEM抵抗,下調TIMP1表達則可逆轉這一過程[25].因此,PDAC基質膠原蛋白在GEM耐藥機制中可能發(fā)揮雙重作用,同時也提示TIMP1可能是潛在的GEM增敏靶點.

2.2 透明質酸 透明質酸(hyaluronic acid,HA)是一種非硫酸化糖胺聚糖,組織中HA在生理狀態(tài)下受到合成和降解動態(tài)平衡的調節(jié)[9].HA在PDAC基質成分中含量最高,HA高表達是PDAC患者的獨立預后因素,并在GEM抵抗中發(fā)揮關鍵作用[26].高吸水特性的HA累積導致腫瘤中的間質液壓力(interstitial fluid pressure,IFP)顯著增加,后者限制了對流,從而降低了灌注血管的溶質通量,并最終導致腫瘤的低灌注,這是GEM抵抗的流體力學機制[27].除此之外,HA與CD44等細胞表面受體結合,通過酪氨酸激酶受體誘導的重要信號通路介導化療抵抗,下調 CD44可逆轉GEM耐藥[28].另外,HA-CD44軸亦可通過增加腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)標記分子Nanog的磷酸化,促進多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1,MDR1)的上調,增加GEM外排,或通過β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的Wnt信號通路誘導EMT,介導GEM耐藥[29,30].因此,靶向HA-CD44信號軸可能是有希望的GEM增敏策略.對此,一項最新的研究設計了一種靶向CD44的新型納米GEM載藥脂質體,并在體外實驗中證實了療效[31].PEGPH20是一種新型聚乙二醇重組透明質酸酶,能夠有效清除基質HA,且在PDAC動物模型中可有效增敏GEM[32].目前,PEGPH20聯(lián)合GEM治療晚期PDAC的部分臨床試驗(NCT01839487,NCT02715804)已獲得積極的結果[33,34].遺憾的是,最近一項有關轉移性PDAC的Ⅲ期臨床試驗(HALO 109-301)則提示,PEGPH20聯(lián)合GEM并未顯示額外的優(yōu)勢,且毒副作用明顯增加[35].值得一提的是,最近兩項研究表明,動態(tài)增強(dynamic contrast-enhanced,DCE)-MRI可用于識別腫瘤微血管的灌注變化[36],SPECT/CT可用于識別新型熒光分子標記的HA-CD44腫瘤細胞[37],這便為PDAC靶向HA治療反應評價提供了可能.

2.3 層粘連蛋白 層粘連蛋白(laminin,LN)是腫瘤ECM組成蛋白中的另一關鍵成分,其與整聯(lián)蛋白結合組成PDAC細胞黏附分子,并與不良預后顯著相關[38].PDAC細胞與LN的粘附以及隨后信號通路的激活參與了GEM抵抗.局灶性粘附激酶(focal adhesion kinase,FAK)是ECM向細胞傳遞信號的關鍵細胞內分子,LN通過誘導FAK/Akt磷酸化,促進生存蛋白(survivin)的表達,抵抗GEM誘導的細胞毒性和凋亡[39].另外,一項最近的異種移植模型研究顯示,PDAC細胞分泌的組織轉谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2,TG2)可刺激間質腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)分泌LN-1,進而增加GEM抵抗,下調TG2則可逆轉這一趨勢[40].除了誘導LN分泌構成基質物理屏障之外,TG2也可通過激活細胞內FAK/PI3K/Akt和NF-κB促生存通路參與GEM抵抗[41].因此,TG2/LN/FAK可能是GEM增敏的潛在靶點,但由于缺少特異性抑制劑,目前相關的研究仍十分有限.

2.4 纖連蛋白 纖連蛋白(fibronectin,FN)也是ECM的主要組成成分之一,可與PDAC細胞表面的黏附受體整聯(lián)蛋白結合,參與細胞內外的信號傳遞,并在GEM抵抗中發(fā)揮重要作用[42].FN除了與其他基質蛋白一樣參與形成基質物理屏障之外,還可通過誘導ERK1/2磷酸化抵抗GEM誘導的細胞凋亡,介導GEM耐藥.體外抑制ERK則可恢復GEM的敏感性[43].因此,靶向FN/ERK有望成為PDAC克服GEM耐藥的潛在策略.

2.5 細胞因子和趨化因子 細胞因子和趨化因子是PDAC細胞與ECM之間的調節(jié)介質,同樣在GEM抵抗中發(fā)揮關鍵作用.其中,結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)可介導間質纖維形成并在PDAC中過表達[44].CTGF還可通過誘導細胞凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)磷酸化,直接抑制caspase-3/7/9介導的凋亡小體形成,參與GEM抵抗[45].體外和異種模型研究表明,靶向抑制CTGF(FG-3019)或XIAP(AZD5582)可通過誘導PDAC凋亡進一步逆轉GEM耐藥[45,46].因此,CTGF/XIAP軸是抗GEM耐藥的潛在靶點.目前,靶向阻斷CTGF的單克隆抗體(pamrevlumab)聯(lián)合GEM治療局部晚期PDAC的新輔助方案正在進行臨床試驗(NCT02210559),初步結果顯示聯(lián)合方案可增加R0切除率且耐受性良好[47].此外,轉化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)也在PDAC中過表達,其通過經典的TGF-β/ALK5/Smad2/3信號通路誘導CYR61表達,后者負調控核苷轉運蛋白hENT1和hCNT3,增加吉西他濱的細胞攝取.最新的多項研究證實,PDAC中TGF-β信號的激活或CYR61的上調促進了GEM耐藥,靶向抑制TGF-β/CYR61則可實現(xiàn)GEM增敏[48-50].另外,TGF-β還通過調控VAV1基因甲基化來促進EMT并介導GEM耐藥,靶向抑制TGF-β/VAV1軸則可顯著增強GEM的療效[51].因此,靶向TGF-β/CYR61/VAV1也是GEM增敏的潛在策略.

眾所周知,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有關鍵作用,其表達與不良預后密切相關[52].其中,EGFR是生長因子受體酪氨酸激酶ErbB的家族成員,可在40%-60%的PDAC中表達.臨床前研究顯示,GEM可通過激活HAb18G(CD147)/EGFR/STAT3促生存信號通路,誘導PDAC對GEM獲得性耐藥[53,54].靶向抑制HAb18G(CD147)或EGFR/STAT3信號則可逆轉GEM抗性[54,55].因此,HAb18G(CD147)/EGFR/STAT3軸是克服GEM耐藥的潛在靶點.遺憾的是,EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)聯(lián)合GEM較GEM單藥治療可切除或晚期PDAC的臨床試驗均未顯示無病生存期(disease-free survival,DFS)或OS的改善[56-58],VEGFR-TKIs聯(lián)合GEM的Ⅲ期臨床試驗(NCT00471146)也宣告失敗[59].TKIs誘導的細胞快速反饋代償機制可能是試驗失敗的原因之一[60].

此外,胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)與其受體IGF-1R的結合可激活PI3K/Akt/mTOR、MEK/ERK通路,促進PDAC增殖并誘導GEM耐藥[61].靶向抑制IGF-1R可增強GEM在PDAC異種移植物的抗腫瘤效果[62].目前,人源IGF-1R單克隆抗體已經在幾種癌癥中應用,但針對轉移性PDAC聯(lián)合GEM治療的III期臨床試驗(NCT01231347)并未取得成功[63].令人振奮的是,最近一項針對進展期PDAC的I/II期臨床試驗(NCT00769483)顯示,IGF-1R抑制劑聯(lián)合GEM+EGFRTKIs較GEM+EGFR-TKIs可顯著改善OS[64].另外,血小板衍生生長因子-D(platelet-derived growth factor-D,PDGF-D)是誘導PDAC間質纖維化和IFP遞增并參與GEM耐藥的關鍵因子,這一過程可能是通過PI3K/Akt、mTOR、NF-κB、ERK、MAPK、Notch通路觸發(fā)EMT實現(xiàn)的[65].雖然PDGFR抑制劑聯(lián)合GEM在臨床前研究中可顯示療效[66],但遺憾的是,最近完成的臨床試驗均宣告失敗[67-69].

除了細胞因子之外,趨化因子配體(CXC ligand,CXCL)與其受體(CXC chemokine receptor,CXCR)結合通過PDAC間質細胞的旁分泌和癌細胞自分泌信號傳導參與GEM抵抗,其中一個關鍵的軸心是CXCL12/CXCR4[70].CXCR4是細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,其在PDAC中高表達且與不良預后密切相關[71].CXCL12/CXCR4軸可激活FAK、ERK和Akt促生存通路,增強β-catenin和NF-κB的轉錄活性,促進Survivin的表達,誘導GEM耐藥[72].臨床前研究顯示,CXCR4拮抗劑可顯著增強GEM的療效[72-74].近年來,不斷有新的CXCR通路被揭示,并且相關通路的體外抑制亦顯示了類似的效果[75,76].可以預見,靶向CXCR將是未來GEM增敏研究的熱點之一.

3 GEM與間質細胞

間質細胞是TME的重要成員(圖1),其通過直接細胞間接觸和細胞旁分泌(ECM蛋白)途徑與PDAC細胞相互作用,共同參與GEM耐藥.

3.1 胰腺星狀細胞和CAFs 胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells,PSCs)是PDAC中最重要間質細胞成分之一,其可被TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-2、IL-10和PDGF激活從靜止的表型轉變成CAFs,后者通過分泌ECM蛋白構建纖維化間質和乏氧的TME,促進GEM耐藥[77,78].PSCs除了參與構建GEM耐藥的物理屏障之外,還可通過與PDAC細胞直接接觸和旁分泌細胞因子途徑誘導GEM抗性.體外共培養(yǎng)研究證實,PSCs可通過增加PDAC細胞Hes1(Notch信號通路組成部分)的表達激活Notch信號通路,后者通過增強EMT和CSCs表型誘導GEM耐藥.當抑制Hes1基因表達或Notch通路時,PSCs誘導的化療耐藥被有效地逆轉[79].因此,靶向Hes1/Notch信號通路可能是逆轉GEM耐藥的策略之一.體外三維(three-dimensional,3D)共培養(yǎng)研究顯示,PSCs可通過分泌肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)與PDAC細胞受體酪氨酸激酶c-Met結合并誘導其磷酸化,后者通過PI3K/Akt/mTOR促生存通路的激活誘導GEM抗性[80].臨床前c-Met靶向抑制劑聯(lián)合GEM可顯著增強其療效[80,81],Ⅰ期臨床試驗(NCT00874042)亦證實兩者聯(lián)合應用有良好的安全性和耐受性[82].因此,靶向抑制HGF/c-Met通路將是有希望的GEM增敏策略.此外,PSCs分泌的骨膜蛋白(Periostin)賦予GEM抵抗力,沉默其表達可逆轉GEM抗性,這一過程可能與GEM誘導凋亡的抑制有關[83].最近一項研究顯示,PSCs可通過分泌脫氧胞苷(deoxycytidine,dC)保護PDAC免受GEM的毒性,但具體機制仍不清楚,可能與GEM細胞內代謝的脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,dCK)競爭作用有關[84].因此,Periostin或基質dC也可能是GEM增敏的潛在靶點.在PDAC中,CAFs主要來源于PSCs的活化,少部分由靜止的成纖維細胞、間充質干細胞或腫瘤細胞EMT衍生而來[85].以α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、成纖維細胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)和成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein 1,FSP1)表達為特征表型的活化CAFs對GEM天然耐藥,并可通過多種機制誘導獲得性耐藥[86].遺憾的是,轉基因小鼠模型研究顯示,靶向耗竭α-SMA表型的CAFs并未增加GEM對PDAC的療效,但卻上調了細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)的表達,且靶向CTLA-4的抗體療法可提高整體生存率[87].有趣的是,最近的一項研究亦顯示,預先GEM處理可促進程序性細胞死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)的表達,并隨后對聯(lián)合PD-1免疫療法敏感[88].因此,GEM可能通過重塑PDAC的TME增加了免疫靶點的表達,聯(lián)合免疫療法可能是GEM耐藥二線治療的潛在策略.盡管在臨床前模型中,靶向抑制FAP可提高化療療效[89],但較早的一項II期臨床試驗卻顯示,FAP抑制劑與GEM聯(lián)合對轉移性PDAC的療效改善仍十分有限[90].此外,Hedgehog(HH)信號通路及其配體之一Sonic Hedgehog(SHH)是CAFs活化的有效調節(jié)因子,參與PDAC的增殖和損傷修復,但其在誘導GEM耐藥中的作用仍存有爭議[24].盡管臨床前研究顯示,小分子抑制劑阻斷SHH通路可提高GEM敏感性[91,92],但隨后與GEM聯(lián)合治療晚期PDAC的II期臨床試驗卻均告失敗[93,94].另外,基因組分析表明,白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥介質在耐GEM的CAFs中過表達且耐藥性與IL-6水平呈正相關[95],這提示CAFs誘導的GEM抗性可能有促炎癥通路的參與[96].有趣的是,一項表征CAFs的3D共培養(yǎng)研究揭示了在PDAC中兩種α-SMA、IL-6表達程度高低不同且作用相反的CAFs亞型存在,該研究強調了間質CAFs的異質性[97],這也可能是上述臨床試驗失敗的原因之一[86].最近一項研究顯示,耐GEM的CAFs細胞外囊泡即外泌體(exosomes)的釋放顯著增加,這些外泌體通過激活間充質轉錄因子Snail,促進EMT并最終誘導GEM抗性[98].其中,外泌體中的miRNA-106b可能在這一過程中起重要作用[99].用外泌體釋放抑制劑或miRNA-106b抑制劑處理耐GEM的CAFs顯著降低了共培養(yǎng)的PDAC細胞存活率[98,99],這表明外泌體可能是克服GEM耐藥的潛在靶點.

3.2 CSCs CSCs是PDAC中一類具有干細胞特征的特殊細胞群,維持腫瘤的形成和生長.CSCs在GEM耐藥中的作用逐漸引發(fā)關注,但確切的細胞和分子機制尚未完全闡明[100].體外研究顯示,CSCs可通過EMT表型轉化逃避GEM細胞毒性作用[101].HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)是一類由GEM誘導CSCs產生的長非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNA),其可通過促進增殖和抑制凋亡,誘導GEM抗性[102].最近一項研究亦顯示,CSCs可上調非編碼微小RNA(microRNA,miRNA)中的miR-210表達并增加外泌體miR-210的釋放,進一步通過PI3K/Akt/mTOR促生存通路活化,促進PDAC細胞的GEM抵抗[103].因此,靶向CSCs及相關非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)有望成為新的GEM增敏策略.

4 免疫細胞

炎癥細胞浸潤和免疫抑制是PDAC的特征之一[104],參與的免疫細胞包括腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)、腫瘤相關嗜中性粒細胞(tumorassociated neutrophils,TANs)、骨髓來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、腫瘤浸潤T淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)和血小板(platelets,PLTs)(圖1).PDAC中的免疫細胞并非GEM耐藥的孤立觀察者,而是這一過程的重要參與者.

4.1 TAMs 消除凋亡細胞是TAMs最重要的功能之一,M2型極化的TAMs可通過激活轉錄因子STAT3直接增強CSCs的腫瘤起始能力[105],并通過下調caspase-3通路活化抑制GEM誘導的細胞凋亡[106],促進GEM抵抗.體外試驗顯示,靶向抑制集落刺激因子-1受體(colony stimulating factor-1 receptor,CSF-1R)或趨化因子(CC基序)受體2(C-C motif chemokine receptor 2,CCR2)可選擇性清除TAMs,進一步提高GEM的療效[105,106].此外,活化的STAT3還可通過上調胞苷脫氨酶(cytidine deaminase,CDA;一種可將GEM由活性形式代謝為非活性的酶)的表達和基質重塑促進GEM耐藥[106,107].動物模型研究顯示,聯(lián)合STAT3靶向抑制劑可明顯提高GEM的療效[107].因此,靶向TAMs/STAT3可能是有潛力的GEM增敏策略[108,109].值得關注的是,TAMs具有高度可塑性,既可以極化成致瘤且對化療耐藥的M2型,也可以極化成抗瘤且對化療敏感的M1型[110].因此,TAMs定向轉化將是除TAMs耗竭之外另一重要的GEM增敏路徑[111,112].

表 1 PDAC細胞外GEM耐藥的潛在靶點和機制

圖 1 PDAC細胞與細胞外TME各組分的結構分布與關系.PDACs:胰腺導管腺癌細胞;PSCs:胰腺星狀細胞;CAFs:腫瘤相關成纖維細胞;CSCs:腫瘤干細胞;TAMs:腫瘤相關巨噬細胞;CKs:細胞因子/趨化因子;TANs:腫瘤相關嗜中性粒細胞;MDSCs:骨髓來源抑制細胞;TILs:腫瘤浸潤T淋巴細胞;PLTs:血小板;Exosomes:外泌體;ECM:細胞外基質.

4.2 TANs與MDSCs TANs是炎癥和免疫狀態(tài)的關鍵調節(jié)劑,在PDAC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[113].同TAMs類似,TANs亦可由TME中不同的趨化因子誘導極化成抗瘤(N1)或促瘤(N2)表型[114].盡管TANs的數量和比例是包括PDAC在內的實體腫瘤公認的預后生物標志物[115],但TANs與GEM耐藥的關系目前仍知之甚少.盡管如此,TANs的可塑性研究已逐漸成為熱點領域之一[116],并可能成為GEM增敏的潛在靶點.MDSCs是源自骨髓祖細胞的異質免疫細胞群,以粒細胞樣MDSCs(granulocytic myeloid de-rived suppressor cells,G-MDSCs)亞型在腫瘤中分布最為廣泛[117],其可通過抑制T細胞免疫和促進血管生成加速腫瘤進展[118].因此,MDSCs又被稱為抑制T細胞的嗜中性粒細胞.同樣,循環(huán)中的MDSCs水平已證實與PDAC的不良預后密切相關[119].一項最近的體外研究顯示,GEM通過誘導MAPK信號通路的活化和NF-κB啟動子活性,進一步增加與KRAS突變相關的主要細胞因子-粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的釋放,進而增強PDAC中MDSCs的分化并促進其耐藥.用抗體靶向中和GM-CSF可以有效降低MDSCs的比例,并有助于T細胞功能的恢復,逆轉GEM耐藥[120].但值得注意的是,GM-CSF還可通過刺激樹突狀細胞來誘導或激活抗腫瘤的T細胞免疫,并基于這一原理設計了GM-CSF基因轉染的胰腺腫瘤疫苗(GVAX)[121],這表明GM-CSF在PDAC的TME中可能發(fā)揮雙向的作用.這或許是一項針對GM-CSF+端粒酶疫苗GV1001聯(lián)合/不聯(lián)合GEM治療晚期PDAC的Ⅲ期臨床試驗(ISRCTN4382138)失敗的原因之一[122].遺憾的是,由于缺乏特異性的表型標志,目前還無法有效的區(qū)分TANs和MDSCs,因此相關研究之間的可比性和可靠性尚待進一步確認[116,117].

4.3 TILs TILs包含細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)、輔助T細胞(helper T cell,Th)、調節(jié)T細胞(regulatory T cells,Tregs)等多種亞型,是參與抗腫瘤免疫和調控免疫檢查點的關鍵介質.其中,PD-1和CTLA-4是TILs備受關注的抑制性免疫檢查點受體,可負性調控其抗腫瘤免疫[123].研究證實,CTLs的高浸潤水平與PDAC良好預后呈正相關[124],這也是目前免疫檢查點靶向阻斷治療的理論基礎.遺憾的是,目前針對PD-1/L1和CTLA-4免疫檢查點的單一抑制劑療法均未顯示對PDAC有效[125].一項新的異種模型研究表明,GEM可通過誘導T細胞免疫增加對PD-1和CTLA-4抑制劑的敏感性,GEM聯(lián)合免疫檢查點抑制劑可提高PDAC的生存率[126],但實際療效仍需臨床試驗進一步驗證[127].此外,HEAT重復序列的蛋白1(HEAT repeat-containing protein 1,HEATR1)可負性調控Akt信號通路誘導效應CTLs發(fā)揮抗腫瘤免疫效應,但其在PDAC中普遍下調且與GEM耐藥密切相關[128].一項最新的研究顯示,HEATR1下調還能通過激活核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)信號傳導,后者進一步促進其下游抗氧化和細胞保護性基因的轉錄,最終導致GEM耐藥[128,129].因此,HEATR1/Nrf2可能是GEM化療增敏的潛在靶點.

4.4 PLTs血液高凝和靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)風險是PDAC的特征之一,這提示PDAC發(fā)生發(fā)展與PLTs密切相關[130].PDAC細胞可以誘導PLTs活化和聚集,PDGF有助于腫瘤進展和GEM耐藥[131-134].對具有缺氧特征TME的PDAC,二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)是重要的PLT激動劑.最近,靶向PLT的ADP-P2Y12受體逐漸引發(fā)了研究人員的興趣[135].P2Y12屬于嘌呤能P2(purinergic receptor P2)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs),ADP與P2Y12受體結合可激活PLT,進一步上調EMT相關轉錄因子Slug、ZEB1的表達,并下調GEM轉運蛋白hENT1和GEM代謝酶CDA的表達,誘導GEM耐藥[133,134].臨床前研究證實,ADP–P2Y12軸抑制劑(ticagrelor)聯(lián)合GEM治療PDAC有明顯的協(xié)同作用,但單一使用則未顯示療效[134].最近,一項氯吡格雷(P2Y12抑制劑)聯(lián)合GEM治療PDAC的臨床試驗(NCT02404363)正在進行,結果令人期待.此外,由于P2Y12-EGFR的信號串擾,抑制P2Y12信號還可顯著增強抗EGFR治療的療效[134],但具體機制尚不明確,這提示P2Y12抑制劑+GEM聯(lián)合EGFR-TKIs可能是治療PDAC的潛在策略.

5 結論

隨著研究的不斷深入,以結締組織廣泛增生為特征的PDAC細胞外TME在GEM耐藥中的關鍵作用逐漸被揭示(表1).但遺憾的是,針對TME相關分子途徑的靶向治療并未取得令人滿意的結果,甚至基質的物理屏障作用也受到質疑[136].其中,關鍵的原因包括:PDAC自身及所屬TME的異質性;TME成分可能的雙向作用;缺乏有效的選擇性抑制劑,以及替代代償途徑的快速上調.此外,目前多數的研究證據均來自體外試驗模型,PDAC細胞與TME間復雜生物學行為仍不能在臨床前模型中完全重現(xiàn),這一原因同樣不可忽視[137].因此,要提高GEM化療有效率,改善PDAC的總體預后,上述原因都將是未來要迫切解決的關鍵問題.值得關注的是,GEM對TME重塑作用的深入研究也有望指導多靶點的聯(lián)合治療,最終可能改變未來PDAC的治療格局.