丁 偉，朱 薇，呂大倫，李 敏，端木龍勝

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 燒傷整形科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

人惡性黑色素瘤，簡稱惡黑，是起源于皮膚黑色素細(xì)胞的惡性疾患，大約占皮膚所有惡性腫瘤的10%[1]，惡性程度極高，我國晚期惡黑患者5年生存率僅為24%～29%[2]。本病病因及機(jī)制不完全清楚，與惡黑早期診治相關(guān)的發(fā)病機(jī)制研究包括生物標(biāo)志物等近年來多有涉及，到目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道多種長鏈非編碼RNA (lncRNA，>200 bp)與惡黑發(fā)病或腫瘤增殖相關(guān)[3]。

肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(lung cancer associated transcript 1，LUCAT1)位于5號(hào)染色體，2013年首次在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[4]，目前LUCAT1與惡黑之間的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道較少，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法驗(yàn)證LUCAT1在惡黑中的表達(dá)，通過qRT-PCR技術(shù)對比檢測人惡黑細(xì)胞SK-MEL-1、A375和正常人表皮黑色素細(xì)胞HEMn-LP中LUCAT1的表達(dá)情況；并通過siRNA技術(shù)下調(diào)LUCAT1表達(dá)，運(yùn)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MTT實(shí)驗(yàn)探索LUCAT1對細(xì)胞生長能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 qRT-PCR試劑盒購自大連Takara公司。RNA抽取所用Trizol 試劑盒購自上海碧云天生物科技公司。轉(zhuǎn)染所用脂質(zhì)體2000試劑購自Invitrogen公司。MTT細(xì)胞增殖試劑盒購自上?？蒲派锕尽８咛荄MEM培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco公司。酶標(biāo)儀來自Tecan infinite，型號(hào)M2009PR。Real time PCR 儀器為Roche公司LightCycler 480。熒光顯微鏡為奧林帕斯公司IX71。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人惡黑細(xì)胞SK-MEL-1、A375以及正常人表皮黑色素細(xì)胞HEMn-LP來自中科院上海細(xì)胞庫。SK-MEL-1細(xì)胞最初提取自一位淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡黑的29歲男性患者，低轉(zhuǎn)移性A375細(xì)胞從一54歲女性皮膚惡黑分離獲得，正常人表皮黑色素細(xì)胞HEMn-LP是從正常新生兒淺色素包皮組織分離獲得的表皮黑素細(xì)胞。所用DMEM培養(yǎng)基含有10% 胎牛血清(Gibco公司)，于37℃ 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，傳代使用胰蛋白酶消化，按照1∶4的比例進(jìn)行。siLUCAT1和陰性對照siRNA(siNC)購自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染操作按脂質(zhì)體2000說明書進(jìn)行，將siLUCAT1或siNC和脂質(zhì)體分別溶于Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，混合后于24孔板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。 使用的siLUCAT1序列正義鏈5′-CCCAUCAGAAGAUGUCAGAAGAUAA-3′，反義鏈5′-UUAUCUUCUGACAUCUUCUGAUGGG-3′。

1.3 MTT細(xì)胞增殖檢測 將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以2 ×103個(gè)/孔密度鋪于96孔板中，設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔，按說明書操作，每孔加入10 mLMTT試劑后，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，用熒光相差顯微鏡觀察記錄拍照細(xì)胞形態(tài)及密度，同時(shí)用酶標(biāo)儀檢測波長為570 nm吸光值。連續(xù)檢測5 d，每天同一時(shí)間進(jìn)行檢測，繪制細(xì)胞生長曲線，觀察細(xì)胞生長繁殖能力。

1.4 qRT-PCR 采用RNA抽取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用二步法進(jìn)行Real-Time PCR，并制作熔解曲線，擴(kuò)增LUCAT1和內(nèi)參GAPDH基因。引物序列：GAPDH正向引物5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′；反向引物5′-TGTCATCATAC-

TTGGCAGGTTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為309bp；LUCAT1正向引物5′-ACCAGCTGTCCCTCAGTGTTCT-3′，反向引物5′-AGGCCTTTATCCTCGGGTTGCCT-3′?；虮磉_(dá)量采用相對定量分析，即2-△△Ct法(ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值)。

2 結(jié)果

2.1 在惡黑組織中分析LUCAT1表達(dá) TCGA(The Cancer Genome Atlas)中下載惡黑數(shù)據(jù)GDC TCGA Melanoma(SKCM)，進(jìn)行差異表達(dá)分析，該數(shù)據(jù)采用RNA-Seq方法檢測，數(shù)據(jù)中原始表達(dá)量進(jìn)行fpkm變換，去除表達(dá)量為0的標(biāo)本，共納入169例原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤標(biāo)本，55例對照組標(biāo)本(部分來源于正常血檢)。如圖1所示，惡黑組LUCAT1表達(dá)水平(0.232±0.371)高于對照組(0.156±0.133)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t′=-2.245，P<0.05)。

圖1 惡黑和正常組織LUCAT1 表達(dá)量對比

為了進(jìn)一步研究LUCAT1與其他基因的相互關(guān)系，本研究利用該TCGA數(shù)據(jù)，分析所有觀測基因的表達(dá)量與LUCAT1之間的相關(guān)性(Pearson相關(guān)分析)，按相關(guān)系數(shù)排序，分別選取與LUCAT1正相關(guān)和負(fù)相關(guān)基因各25個(gè)進(jìn)行熱圖繪制。如圖2所示，這可能對本研究后續(xù)分析LUCAT1與其他基因的相互作用尋找突破口。

圖2 熱圖顯示與LUCAT1具有正、負(fù)相關(guān)的基因情況

2.2 惡黑細(xì)胞SK-MEL-1、A375以及人正常黑色素細(xì)胞HEMn-LP中LUCAT1的表達(dá)分析 為進(jìn)一步驗(yàn)證LUCAT1在惡黑的表達(dá)情況，本研究用qRT-PCR分別檢測了惡黑細(xì)胞和正常黑色素細(xì)胞中LUCAT1的表達(dá)，相對于正常黑色素細(xì)胞HEMn-LP的LUCAT1表達(dá)量(1.040±0.340)，惡性細(xì)胞SK-MEL-1、A375表達(dá)量(2.700±0.580、2.460±0.177)上升(n=3，F(xiàn)=15.728,P=0.005)，提示LUCAT1可能和惡黑的惡性發(fā)展相關(guān)。

2.3 下調(diào)LUCAT1對SK-MEL-1、A375細(xì)胞生長的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證LUCAT1對惡黑細(xì)胞生長的影響，本研究繼續(xù)選取SK-MEL-1、A375兩種惡性細(xì)胞，利用siRNA技術(shù)下調(diào)了LUCAT1的表達(dá)，并用RT-PCR驗(yàn)證了下調(diào)的效果，如圖3所示。利用GFP標(biāo)記的綠色熒光，從圖4，可以直觀地看到細(xì)胞生長在下調(diào)LUCAT1后受到了明顯的抑制；并利用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，SK-MEL-1細(xì)胞中，siLUCAT1組在24 h和72 h較siNC組MTT細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.05)，而在A375細(xì)胞中，siLUCAT1組在24 h和48 h較siNC組MTT細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.05)(表1)。

siLUCAT1組相對于siNC組在SK-MEL-1(A：1.000±0.026 vs. 0.500±0.035；n=3，t=19.863，P=0.000)和A375(B：1.000±0.046 vs. 0.395±0.090；n=3，t=10.282，P=0.009)，**P<0.01。

siLUCAT1組相對于對照組，細(xì)胞生長受到抑制。

表1 siLUCAT1和siNC組在SK-MEL-1和A375中MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)比較

3 討論

近年來，靶向治療在惡黑的治療中取得了很大進(jìn)步，針對MAPK/ERK信號(hào)通路分子的特異抑制劑得到臨床應(yīng)用，免疫治療在惡黑治療中同樣占據(jù)非常重要的地位。但是這些治療遠(yuǎn)沒有達(dá)到治愈的目的，惡黑目前仍缺乏行之有效的靶點(diǎn)，也缺乏有效生物標(biāo)志物判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療。現(xiàn)有研究表明在惡黑中存在很多個(gè)lncRNA可能參與腫瘤細(xì)胞生長和侵襲過程，如MALAT1、Hotair、Bancr、Spry4-it1、Anril、Llme23等多種lncRNA[3,5]證實(shí)在惡黑中異常表達(dá)。

LUCAT1最早發(fā)現(xiàn)于肺癌中，位于5號(hào)染色體，初步測序分析其轉(zhuǎn)錄本上具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。LUCAT1也被稱為SCAL1(smoke and cancer associated lncRNA 1)，在肺癌細(xì)胞上有明顯表達(dá)升高，初步研究表明LUCAT1受NRF2調(diào)節(jié)介導(dǎo)呼吸氣道上皮細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控和氧化應(yīng)激過程[4]。Sun等進(jìn)一步證實(shí)了LUCAT1通過p21和p57的表觀遺傳學(xué)抑制從而調(diào)控了腫瘤增殖和細(xì)胞周期[6]。于貴林證實(shí) LUCAT1 在胃癌腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并與靜脈侵犯和癌腫遷移均存在相關(guān)性，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)可能與上調(diào) FPR2 表達(dá)有關(guān)[7]。另外，相繼發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌[8]、食管癌[9]、膠質(zhì)瘤[10]、腎細(xì)胞癌[11]、肝癌[12]、乳腺癌[13]、宮頸癌[14]中都觀察到相似的結(jié)果，LUCAT1 的表達(dá)均高于相鄰的非腫瘤性正常組織，通過下調(diào) LUCAT1后可以顯著抑制腫瘤的生長侵襲，提示LUCAT1 作為促癌基因在很多惡性腫瘤中起到了促增殖作用，但在不同腫瘤中其具體的促癌機(jī)制不甚相同，其具體的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。目前文獻(xiàn)有關(guān)LUCAT1在惡黑中的研究不多，其在惡黑中生長和增殖的生物學(xué)作用和調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢測了惡黑組織LUCAT1表達(dá)高于正常對照組，并通過相關(guān)分析方法確立了與之正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因，這可能是LUCAT1促進(jìn)腫瘤增殖的調(diào)控路徑中的重要分子，值得進(jìn)一步研究。本研究運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在惡黑細(xì)胞SK-MEL-1、A375中相對于正常黑色素細(xì)胞呈明顯高表達(dá)狀態(tài)，利用MTT檢測結(jié)果表明抑制LUCAT1表達(dá)后細(xì)胞生長得到抑制，這些數(shù)據(jù)均表明LUCAT1與惡黑的發(fā)展可能密切相關(guān)。

綜上所述，LUCAT1可能上調(diào)惡黑細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤的生長，但其具體的分子生物學(xué)機(jī)制如下游的靶分子仍需要進(jìn)一步研究深入探討，為惡黑的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。