安潔，周琴，曹珍珍，郭小晶

昆山市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 昆山 215300

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種多因素、多系統(tǒng)、臨床表現(xiàn)多樣的復(fù)雜疾病[1]。該病還具有較高的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，如高血壓、糖尿病、心血管疾病、乳腺及子宮內(nèi)膜病變等，嚴(yán)重危害了女性的身心健康。研究證實(shí)，PCOS患者不僅存在生殖障礙和激素失衡，而且腸道微生物群明顯失調(diào)。有研究提出，性激素與腸道菌群間存在潛在的“雙向互動”關(guān)系[2]。腸道微生物群可能在PCOS的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色[3-4]。中醫(yī)藥防治PCOS有其獨(dú)特優(yōu)勢，且臨床療效斐然。中藥及其有效成分、復(fù)方制劑等可以通過直接或間接方式參與調(diào)控腸道菌群(結(jié)構(gòu)、組成、功能)及其代謝產(chǎn)物來防治如肥胖、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病[5]。其中補(bǔ)腎、健脾類中藥可以調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善胰島素抵抗、卵巢功能等[6-8]。本研究立足“脾腎”與腸道微生態(tài)相關(guān)性的理論基礎(chǔ)，運(yùn)用16S rDNA擴(kuò)增子測序和生物信息學(xué)方法，分析治療前后脾腎不足型PCOS患者的腸道菌群、腸道通透性及中醫(yī)證候積分等情況，并探討健脾滋陰湯對患者腸道微生態(tài)及內(nèi)分泌的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年8月至2020年1月在昆山市中醫(yī)醫(yī)院就診的脾腎不足型PCOS患者37例。年齡為20～40(28.30±4.62)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)<30 kg·m-2。本研究通過昆山市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審批(審查號：2018-07)，研究對象知情同意簽字。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)①西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2011年12月1日實(shí)施的中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。②中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：參考全國高等醫(yī)藥院校教材《中醫(yī)婦科學(xué)》及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[9-11](2002年版)中關(guān)于月經(jīng)不調(diào)腎虛證與脾氣虛證的辨證標(biāo)準(zhǔn)擬定。

1.3 病例納入標(biāo)準(zhǔn)(自擬)①20～40歲育齡期女性；②符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；③符合中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；④BMI<30 kg·m-2或>18 kg·m-2；⑤知情同意、志愿受試。

1.4 病例排除標(biāo)準(zhǔn) (自擬)近3個(gè)月內(nèi)使用抗生素、益生菌、口服避孕藥或抗糖藥者；消化道疾病，活動性感染者；BMI<18 kg·m-2或>30 kg·m-2者，有減肥史、手術(shù)史、吸煙酗酒者；試驗(yàn)期間自行中斷服藥者。

1.5 治療方法給予健脾滋陰湯，藥物組成：黨參12 g，白術(shù)12 g，茯苓、懷山藥各10 g，山萸肉9 g，廣木香6 g，砂仁(后下)5 g，白芍10 g，荊芥5 g，陳皮 6 g，蓮子肉9 g。以上中藥來源于昆山市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，水煎服，每日1劑，每次200 mL，早晚餐后30 min 口服。從月經(jīng)第5天開始，療程6個(gè)月。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、腸道通透性指標(biāo)[D-乳酸(D-lactate，D-LA)、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)]、胰島素抵抗指數(shù)(homa insulin-resistance，HOMA-IR)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)。

1.6.2 中醫(yī)證候評分參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》制定。主癥：①不孕，月經(jīng)后期或閉經(jīng)，月經(jīng)量少，經(jīng)色淡黯或紫黑，偶有血塊；②腰骶酸痛；③四肢倦怠，按癥狀無、輕、中、重分別計(jì)0分、2分、4分、6分。次癥：①頭暈耳鳴；②性欲減退；③面色淡黃；④不思飲食；⑤食后腹脹，便溏，舌暗苔薄白，脈沉緩。按癥狀無、輕、中、重分別計(jì)0分、1分、2分、3分。各項(xiàng)癥狀評分之和為中醫(yī)癥狀積分。

1.6.3 16S rDNA擴(kuò)增子測序及生物信息分析①糞便采集：采集自然排出的新鮮糞便(2 g以上)，迅速將糞便裝于無菌樣品管中，置于我院檢驗(yàn)科-80 ℃ 超低溫冰箱中保存直至分析使用。②DNA提?。河肈NA提取試劑盒(Qubit? dsDNA HS Assay Kit)從樣本中提取DNA。③PCR擴(kuò)增及文庫構(gòu)建：以20～30 ng DNA為模板，使用金唯智生物公司設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增原核生物16S rDNA。并采用CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT序列的上游引物及GGACTACNVGGGTWTCTAATCC序列下游引物來擴(kuò)增可變區(qū)(V3、V4)。同時(shí)向PCR產(chǎn)物末端加上帶Index的接頭來進(jìn)行NGS測序。PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性參數(shù)94 ℃ 3 min×1，變性參數(shù)94 ℃ 5 s，退火參數(shù)57 ℃ 90 s，延伸參數(shù)72 ℃ 10 s，終延伸參數(shù)72 ℃ 5 min，共計(jì)要進(jìn)行24個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增后結(jié)果的鑒定：產(chǎn)物選擇1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。④樣本上機(jī)測序：先通過酶標(biāo)儀進(jìn)行文庫濃度檢測，將文庫定量到10 nmol·L-1，全部按Illumina MiSeq/NovaSeq(Illumina，San Diego，CA，USA)儀器說明書進(jìn)行雙端的測序，再運(yùn)用相關(guān)軟件進(jìn)行序列信息讀取。⑤數(shù)據(jù)分析：上機(jī)后對測序所得正反向reads結(jié)果兩兩間進(jìn)行拼接，嚴(yán)格過濾掉測序結(jié)果中含N的序列，將大于200 bp序列長度保留，進(jìn)行下一步質(zhì)量過濾，篩查出所需要清除的嵌合體序列，最終結(jié)果進(jìn)行OTU聚類分析[運(yùn)用VSEARCH(1.9.6)版本]，序列聚類分析定性為相似性97%(參考數(shù)據(jù)庫Silva132)。研究選用了貝葉斯算法分析OTU中代表性的序列，統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)樣本群落組成。

1.7 臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)參照2012年發(fā)布中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)(中醫(yī)婦科病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn))及衛(wèi)生部《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002年版)[11-12]，記錄治療前后的癥狀變化并分別進(jìn)行評分，計(jì)算療效指數(shù)，以判定療效。痊愈：主癥、次癥消失或基本消失，療效指數(shù)≥95%；顯效：70%≤療效指數(shù)<95%；有效：30%≤療效指數(shù)<70%；無效：療效指數(shù)<30%。

有效率=(痊愈+顯效+有效)/n×100%

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)療效治療后37例患者有效率為86.4%，其中痊愈為40.5%，顯效為29.7%，有效為16.2%，無效為13.5%。

2.2 治療前后中醫(yī)證候評分比較治療后患者的中醫(yī)證候評分較治療前明顯下降。(P<0.01)，見表1。

表1 治療前后中醫(yī)證候評分比較

2.3 治療前后臨床參數(shù)分析

2.3.1 治療前后BMI、性激素、HOMA-IR、TG、TC比較配對秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，進(jìn)行中醫(yī)治療后患者的BMI低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=121.50，P=0.001)。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，治療后患者的LH(t=5.46，P<0.001)、T(t=8.28，P<0.001)、HOMA-IR(t=4.82，P<0.001)、TG(t=3.71，P=0.014)水平均低于治療前，見表2。

表2 治療前后BMI、性激素、HOMA-IR、TG、TC比較

2.3.2 治療前后腸道通透性指標(biāo)比較配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，進(jìn)行中醫(yī)治療后患者的D-LA(t=-2.07，P<0.05)、DAO(t=-2.12，P<0.05)顯著低于治療前，見表3。

表3 治療前后腸道通透性指標(biāo)比較

2.3.3 臨床指標(biāo)與D-LA、DAO水平的關(guān)系分析兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果顯示，D-LA、DAO與BMI、LH/FSH、T、HOMA-IR無明顯關(guān)系。但從數(shù)據(jù)分組可以看出，LH/FSH值、T、HOMA-IR水平越高的患者腸道D-LA、DAO趨于升高，可能和入組樣本量過小有關(guān)。詳見表4、表5。

2.4 腸道菌群結(jié)果分析

2.4.1 PCOS屬水平物種進(jìn)化樹Top30的屬水平的OTU序列見圖1。根據(jù)最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹，利用R語言作圖，PCOS腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)為主要優(yōu)勢菌群。

2.4.2 腸道菌群組成結(jié)構(gòu)分析統(tǒng)計(jì)治療前后兩組樣本在門、屬水平豐度>1.00%的物種，繪制柱狀圖(圖2)。其中，圖2a為屬水平，相對豐度差異顯著的菌種有：治療前Blautia 40.34%，Bifidobacterium 8.15%，Subdoligranulum 8.72%，Bacteroides 8.14%，治療后Blautia 12.91%，Bifidobacterium 16.09%，Subdoligranulum 20.01%，Bacteroides 19.78%(P<0.05)。圖2b為門水平，主要由厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門4個(gè)菌群組成，其中厚壁菌門占比最多。治療前后相對豐度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4.3 治療前后屬水平前5位豐度差異性分析兩組樣本中的差異最大的5個(gè)菌種的豐度分布見圖3。橫坐標(biāo)為兩組樣本差異最大的5個(gè)菌種分類名稱，縱坐標(biāo)為菌種的相對豐度。我們選擇了屬水平進(jìn)行分析，屬水平豐度差異明顯的菌種有布勞特菌屬Blautia、真桿菌屬[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、乳酸球菌屬Lactococcus、瘤胃菌科Ruminococcus_1、Subdoligranulum。

表4 臨床指標(biāo)與D-LA水平的關(guān)系分析

表5 臨床指標(biāo)與DAO水平的關(guān)系分析

注：屬水平物種的代表序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，分支的顏色表示其對應(yīng)的門，不同的顏色代表一個(gè)門

圖2 門水平、屬水平豐度差異柱狀圖

2.4.4 LEfSe分析采用LEfSe多級物種差異判別分析尋找治療前后的特征性物種(LDA>2表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，LDA分值越大，代表物種豐度對差異效果影響越大(圖4)。治療前真桿菌屬(g_Eubacterium_coprostanoligenes_group)、鏈球菌科(f_Peptostreptococcaceae)、羅姆布茨菌屬(g_Romboutsia)相對豐度較高；治療后Subdoligranulum相對豐度增高(P<0.05)。

2.4.5 屬水平群落組成與環(huán)境因子相關(guān)性分析環(huán)境因子與物種間的Spearman相關(guān)系數(shù)分析見圖5。a圖為治療前Agathobacter、瘤胃球菌(Ruminococcus_2)、Subdoligranulum與LH呈正相關(guān)，糞球菌(Coprococcus_3)與BMI呈負(fù)相關(guān)，Ruminococcus_2與E2呈負(fù)相關(guān)，鏈球菌(Streptococcus)與TC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Ruminococcus_2與TG呈正相關(guān)(P<0.01)。b圖為治療后丁酸球菌屬(Butyricicoccus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)、[Ruminococcus]_torques_group、真桿菌屬([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)與T呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，[Ruminococcus]_gnavus_group與T呈正相關(guān)(P<0.05)，理研菌科(Alistipes)與BMI呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Ruminococcaceae_UCG-002與LH呈正相關(guān)(P<0.01)，Coprococcus_3與HMOA-IR呈正相關(guān)(P<0.05)。

圖3 治療前后屬水平前5位豐度差異性分析

圖4 治療前后菌群LDA圖

3 討論

近年來，學(xué)者們從“陰陽、正邪、臟象”等各方面中醫(yī)理論出發(fā)，進(jìn)行了各疾病與腸道微生態(tài)之間的相關(guān)性研究，提供了豐富的理論基礎(chǔ)[13-16]。其中之一為腸道菌群與中醫(yī)理論中“脾腎”的生理功能密切相關(guān)，腸道菌群失調(diào)和中醫(yī)脾失健運(yùn)、腎虛互為因果。PCOS的中醫(yī)病因在于腎陰虛，天癸不足[17]，然“脾胃之氣，雖充于脾胃之中，實(shí)生于兩腎之內(nèi)”，夏桂成教授臨癥注重病變的核心，用藥兼顧脾腎同治，健脾助腎以制水、化瘀，而不是“見標(biāo)治標(biāo)”，療效顯著，誠如張景岳所言：“五臟之病……無不由乎脾腎?！本C合現(xiàn)有研究與腸道菌群密切相關(guān)的胰島素抵抗、代謝綜合征的中醫(yī)病機(jī)證候的共性基本為痰濁、脾腎兩虛，二者互為因果。這恰恰與PCOS的病機(jī)本質(zhì)不謀而合，為本研究提供可行性?，F(xiàn)筆者從理論、遣方用藥、腸道微生態(tài)改變幾個(gè)方面進(jìn)行結(jié)果分析。

3.1 從“脾腎”根本出發(fā)，重視“經(jīng)后復(fù)陰”脾胃居五臟之中，經(jīng)脈互連，是太極陰陽圓運(yùn)動之樞紐，后天資血之源。中焦精微化赤以養(yǎng)他臟，女子以血為本，沖脈又隸屬于陽明，若陽明生化乏源，血海不得按時(shí)盈溢，久則沖任失調(diào)，月事失調(diào)。沖任流通，又賴于腎氣全盛，腎精充盈。若無腎中之水氣，則胃氣不能騰；無腎中之火氣，則脾氣不能化。真火上煦，脾陽得溫，脾氣升騰胃氣緩降，納食精進(jìn)，氣運(yùn)如常，朗日當(dāng)空，萬象生機(jī)，月事順調(diào)，胎孕可成。反之，則病由生焉。

《醫(yī)宗必讀》云：“先天之本在腎，腎應(yīng)北方之水，水為天一之源，后天之本在脾，脾應(yīng)中宮之土，土為萬物之母?！毕墓鸪山淌谡J(rèn)為，本病的病理關(guān)鍵在于腎陰不足，脾運(yùn)不健，致經(jīng)后期陰長不及，難達(dá)重陰，以致重陰轉(zhuǎn)陽不利，而陰虛日久及陽，陽虛則痰瘀壅阻，致使卵巢呈多囊樣改變。治療以健脾補(bǔ)腎為主，佐以化痰、疏肝、寧心等法。故而“調(diào)經(jīng)之要，貴在補(bǔ)脾胃以滋血之源，養(yǎng)腎氣以安血之室”，此乃真機(jī)也，恰如“法貴乎活，治貴乎巧”。

3.2 注重協(xié)調(diào)補(bǔ)運(yùn)、動靜結(jié)合健脾滋陰湯實(shí)為參苓白術(shù)散化裁而來。健脾者，健運(yùn)脾胃也；滋陰者，滋養(yǎng)腎陰天癸也。臨證若純補(bǔ)陰，必礙脾；純健脾，易耗陰，二者存在矛盾。夏老在實(shí)踐中去除原方中升散香燥之品，加入了滋陰運(yùn)脾和胃之品。方中黨參、山藥、蓮子肉既益氣健脾，又滋養(yǎng)脾陰，為主藥，意在健脾滋陰，以恢復(fù)陰分為主；輔以白術(shù)、茯苓等健脾滲濕，亦有滋陰之功，以旺后天生化之源，以養(yǎng)先天腎陰；佐以陳皮、木香理氣運(yùn)脾，山萸肉合山藥，乃滋肝、脾、腎三陰。全方滋陰益氣，氣中補(bǔ)陰，陰中益氣，著重脾胃，兼顧肝腎，不膩不燥。

“動、靜、升、降”是中藥藥性理論的重要組成部分?！毒霸廊珪份d：“氣味有陰陽，陰者降，陽者升。陰者靜，陽者動?！毕睦锨卜接盟庬槕?yīng)女性月經(jīng)周期中陰陽氣血顯著活動的特點(diǎn)，認(rèn)為經(jīng)后初期、中期的治則是“靜能生水”。以“靜”為主(白術(shù)、茯苓、山藥、白芍、山萸肉等)，“靜”大于“動”，在于養(yǎng)血滋陰以促陰長、陰陽和調(diào)以助轉(zhuǎn)化；“動”(黨參、木香、砂仁、陳皮等)在于陽中求陰、扶助陽長、疏肝理氣?！办o”可使后天生化之源不斷充養(yǎng)先天之精，使腎氣盛，沖任充；又會稍佐以“助陽”(杜仲、川續(xù)斷等)，利于癸水之陰陽[18]。

3.3 腸道菌群及通透性改變分析腸道微生物群為人體整個(gè)代謝系統(tǒng)的連接者，腸道微生態(tài)失衡，已被證實(shí)與PCOS存在密切相關(guān)性[19-21]。本研究結(jié)果顯示，健脾滋陰湯可以對脾腎不足型PCOS患者的中醫(yī)證候積分、臨床癥狀、性激素、腸道菌群的結(jié)構(gòu)、腸道通透性(DAO、D-LA)產(chǎn)生積極影響。治療后腸道有益菌增加，病原菌減少，腸道通透性得以改善。其中如豐度差異顯著的菌種Blautia、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Lactococcus、Ruminococcus_1、Subdoligranulum均是與短鏈脂肪酸產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)菌。

生信結(jié)果分析方藥干預(yù)后來自厚壁菌門的Bifidobacterium、Subdoligranulum、Ruminococcus和Coprococcus菌屬豐度均有改變，有益菌成分增加。既往研究顯示，它們具有在人體腸道內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的能力，協(xié)調(diào)膽固醇代謝，促進(jìn)腸肝循環(huán)，減少脂多糖入血，緩解代謝性疾病[22]。其中Ruminococcus、Coprococcu與BMI、T呈負(fù)相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，它們在肥胖型PCOS發(fā)病中起著重要作用，并參與糖脂代謝[23]。腸道內(nèi)Bifidobacterium、Lactococcus治療后豐度增加，它們對降低血脂水平的作用尤為突出。研究發(fā)現(xiàn)，它們可產(chǎn)生結(jié)合膽鹽水解酶，完成膽固醇轉(zhuǎn)化[24]。一項(xiàng)基于217名健康人群高脂飲食干預(yù)后的研究發(fā)現(xiàn)，腸道中Alistipes豐度增加，伴隨血漿中促炎因子水平增加[25]，并與BMI呈負(fù)相關(guān)，但治療前后該菌豐度改變無顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后提高了腸道微生物丁酸鹽產(chǎn)生菌(Butyricicoccus、Prevotella)，與T呈負(fù)相關(guān)。研究報(bào)道，它們亦可以緩解腸道炎癥，進(jìn)而減少炎癥對L細(xì)胞損傷，從而改善胰高血糖素樣肽-1水平，保護(hù)腸道黏膜屏障，減少LPS入血[26]。

既往DAO、D-LA的測定常常用來評估胃腸黏膜屏障功能。有研究表明，血清DAO水平受月經(jīng)周期的影響[27]。檢測二者外周血水平可反映早期腸黏膜損害程度和通透性變化。但PCOS患者是否存在異常未見有關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的腸道屏障功能確有改變，我們再進(jìn)行各參數(shù)切入值水平相關(guān)性分析未見明顯差異，但隨著HMOA-IR、T、LH/FSH水平的上升，二者水平趨向升高，或許與入組樣本量小、個(gè)體差異大、樣本數(shù)據(jù)離散等有關(guān)，須進(jìn)一步研究。

綜上，健脾滋陰湯可以同時(shí)對脾腎不足型PCOS患者內(nèi)分泌和腸道微生態(tài)方面產(chǎn)生治療作用。本研究初步表明，腸道菌群與PCOS相關(guān)癥狀的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因而能夠成為緩解和改善PCOS相關(guān)癥狀的治療靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用以腸道菌群為靶點(diǎn)的中醫(yī)藥干預(yù)治療PCOS提供依據(jù)。筆者從腸道微生物-腸道屏障軸角度切入，也揭示了中醫(yī)藥理論的科學(xué)性，延伸了中藥的作用靶點(diǎn)[28]。筆者現(xiàn)已在菌群分析基礎(chǔ)前提下，擴(kuò)大了臨床樣本量，運(yùn)用相關(guān)組學(xué)對差異菌屬進(jìn)行功能預(yù)測，以了解該方對PCOS患者的特異菌群信號通路及代謝途徑的影響。