楊 朋，錢 軍，陳文飛，鄧懷冬

(攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川攀枝花 617000)

神經(jīng)退行性疾病是當(dāng)前威脅老年人生命健康的最主要危險(xiǎn)因素之一，而神經(jīng)炎癥與包括阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)、帕金森疾病(parkinson’s disease, PD)和肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。神經(jīng)炎癥的發(fā)生主要與大腦內(nèi)固有的免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化有關(guān)，過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的促炎性因子，產(chǎn)生神經(jīng)元毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，從而損壞認(rèn)知功能[3]。因此，控制腦內(nèi)神經(jīng)炎癥將有助于神經(jīng)退行性疾病的改善和治療[4-5]。

鹽酸二甲雙胍(metformin, Met)是臨床治療2型糖尿病的一線用藥，能顯著改善胰島素抵抗和降低血糖，還具有抗腫瘤、抗炎及心血管保護(hù)效應(yīng)，并且能透過血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[6-8]。然而，Met能否抑制神經(jīng)炎癥及其抗神經(jīng)炎癥的潛在機(jī)制尚不明確。因此，本研究用Aβ1-42誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞建立神經(jīng)炎癥模型，分別從分子、基因及蛋白水平探究Met對炎性因子表達(dá)的影響及分子機(jī)制，以期為Met治療神經(jīng)炎癥性疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料Met(Sigma，純度99%，貨號(hào)PHR1084)，Aβ1-42、MTT(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，PCR試劑盒(QIAGEN公司)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 RT-PCR引物(Invitrogen)，NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、p-IκB、IκB抗體、RIPA裂解液(Cell Signaling Technology)，β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，蛋白濃度檢測試劑盒(Bio-Rad)，高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)，熒光定量PCR儀、凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1藥物處理稱取適量Aβ1-42溶于滅菌后的PBS中，配成200 μmol/L的儲(chǔ)備液保存于-80 ℃冰箱中，臨用前置于37 ℃孵育7 d，使其成為聚集狀態(tài)。稱取適量Met溶于滅菌后的PBS中，配成1 mol/L的儲(chǔ)備液，保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)BV-2細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫)培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.3.3細(xì)胞分組及處理取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞接種至96孔板(8 000/孔)或6孔板(20萬/孔)，將細(xì)胞分為對照組、模型組(5 μmol/L Aβ1-42)、Met低劑量組(5 μmol/L Aβ1-42+0.5 mmol/L Met)、Met中劑量組(5 μmol/L Aβ1-42+1 mmol/L Met)、Met高劑量組(5 μmol/L Aβ1-42+2 mmol/L Met)。對照組用培養(yǎng)基培養(yǎng)，不用任何藥物處理；模型組用5 μmol/L Aβ1-42處理24 h；Met低劑量組、Met中劑量組、Met高劑量組先用對應(yīng)濃度的Met預(yù)處理6 h，然后再將培養(yǎng)基替換成含5 μmol/L Aβ1-42和對應(yīng)濃度Met的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4MTT法檢測Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞，以8 000/孔接種至96孔板，每孔100 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日棄上清，按照1.3.3項(xiàng)分組方法處理各組細(xì)胞；檢測Met對BV-2細(xì)胞活力的影響時(shí)，將細(xì)胞分為對照組和Met組，對照組正常培養(yǎng)，不用任何藥物處理，Met組直接用對應(yīng)濃度的Met干預(yù)48 h。干預(yù)結(jié)束后棄上清，加入含0.5 mg/mL MTT的DMEM培養(yǎng)基100 μL，在培養(yǎng)箱中孵育3 h后棄上清，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上振搖10 min，然后用多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度(A)，檢測波長為570 nm。根據(jù)吸光度(A)計(jì)算各組相對細(xì)胞活力。

1.3.5ELISA法檢測Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞，以8 000/孔接種至96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜。次日棄上清，開始用藥物干預(yù)，分組及干預(yù)方式同1.3.3項(xiàng)，干預(yù)結(jié)束后取上清按ELISA試劑盒說明書方法檢測各組上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量。

1.3.6RT-PCR法檢測Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞，以20萬/孔接種至6孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)過夜。次日棄上清，分組及干預(yù)方式同1.3.3項(xiàng)。干預(yù)結(jié)束后棄上清，按總RNA提取試劑盒說明書提取各孔細(xì)胞總RNA，檢測濃度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板根據(jù)PCR試劑盒說明書方法檢測各組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平，引物序列見表1。

1.3.7Western blotting法檢測Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞p-IκBα、IκBα、NF-κB、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞，以20萬/孔接種至6孔板，培養(yǎng)過夜。次日棄上清，分組及干預(yù)方式同1.3.3項(xiàng)。干預(yù)結(jié)束后棄上清，PBS潤洗2遍，棄PBS，每孔加入60 μL RIPA裂解液，置于冰上裂解20 min，刮下細(xì)胞，將細(xì)胞與裂解液一起轉(zhuǎn)移到1.5 mL無酶離心管中，置于4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心10 min，然后收集上清液，檢測蛋白濃度后加入5× Loading buffer，95 ℃加熱5 min，冰上驟冷，然后上樣30 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，然后用100 mL/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗凈牛奶，一抗4 ℃孵育過夜。次日棄一抗，TBST洗滌3次，每次5 min，然后二抗室溫孵育1 h，棄二抗，TBST洗滌3次，每次5 min，然后用ECL發(fā)光檢測試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件定量分析圖像。

2 結(jié) 果

2.1 Met對BV-2細(xì)胞活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.5、1、2 mmol/L的Met干預(yù)BV-2細(xì)胞48 h后的細(xì)胞活力與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示0.5、1、2 mmol/L的Met在48 h內(nèi)對BV-2細(xì)胞無明顯毒性。1.25、2.5、5 μmol/L的Aβ1-42誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降(P<0.01)，表明其可不同程度地?fù)p傷BV-2細(xì)胞。Met和Aβ1-42共同處理BV-2細(xì)胞相對于單獨(dú)用Aβ1-42處理的BV-2細(xì)胞活力顯著升高，說明Met可改善Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞活力損傷(圖1)。

與對照組相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

2.2 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響為探究Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響，采用Met和Aβ1-42處理BV-2細(xì)胞，通過ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中炎性因子含量。結(jié)果顯示，BV-2細(xì)胞經(jīng)Aβ1-42誘導(dǎo)后，上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的含量均顯著升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Met干預(yù)后，上清液中炎性因子的含量均呈劑量依賴性下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)，表明Met可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎性因子的表達(dá)。

2.3 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平的影響為探究Met對炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響，通過RT-PCR法檢測各組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA的相對水平。結(jié)果顯示，BV-2細(xì)胞經(jīng)Aβ1-42誘導(dǎo)后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Met干預(yù)后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平呈劑量依賴性下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)，表明Met可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的轉(zhuǎn)錄。

2.4 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為進(jìn)一步探究Met抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，采用Western blotting檢測NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Aβ1-42可促進(jìn)NLRP3、ASC、Caspase-1(p20)表達(dá)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；0.5 mmol/L Met干預(yù)后，NLRP3、ASC、Caspase-1(p20)表達(dá)水平與模型組相比有輕微下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.05)；1 mmol/L Met干預(yù)后，NLRP3、Caspase-1(p20)表達(dá)水平與模型組相比顯著下降(P<0.01)，而ASC表達(dá)水平變化不明顯(P≥0.05)；2 mmol/L Met干預(yù)后，NLRP3、ASC、Caspase-1(p20)表達(dá)水平與模型組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。上述結(jié)果表明，Met可劑量依賴性地抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活。

圖2 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Met on the expressions of inflammatory cytokines in BV-2 cells induced by Aβ1-42 (n=3 in each group)與對照組相比,*P<0.01;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01。

圖3 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平的影響Fig.3 Effect of Met on TNF-α, IL-1, IL-6 and IL-18 mRNA levels in BV-2 cells induced by Aβ1-42 (n=3 in each group)與對照組相比,*P<0.01;與模型組相比,#P<0.01。

圖4 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Met on the protein expressions of NLRP3, ASC and Caspase-1 in BV-2 cells induced by Aβ1-42 (n=3 in each group)與對照組相比,*P<0.01;與模型組相比,#P<0.01。

2.5 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響NLRP3炎性小體的活化受NF-κB通路的調(diào)控，因此本研究進(jìn)一步檢測了NF-κB、p-IκBα、IκBα蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Aβ1-42可顯著促進(jìn)NF-κB、p-IκBα表達(dá)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；0.5、1、2 mmol/L的Met干預(yù)后，NF-κB、p-IκBα表達(dá)水平均明顯下降(P<0.01)，但未呈現(xiàn)典型的劑量依賴效應(yīng)(圖5)。上述結(jié)果表明，Met可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NF-κB通路激活。

圖5 Met對Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞p-IκBα、IκBα、NF-κB(p65)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的固有吞噬細(xì)胞，通過清除大腦中的病原體、異常蛋白和細(xì)胞碎片維持大腦穩(wěn)態(tài)[9]。當(dāng)神經(jīng)元死亡、異常蛋白聚集等病理因素激活小膠質(zhì)細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速向病變部位遷移并立即啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)從而維持機(jī)體正常功能[9]，但持續(xù)過度激活小膠質(zhì)細(xì)胞則會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18等促炎因子，加重腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元死亡，最終導(dǎo)致AD、PD、ALS等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid, Aβ)過度沉積引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是AD發(fā)病的重要原因[10]。Aβ可激活核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)IL-1β、IL-18等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)生[11-12]。此外，Aβ還可激活PARP、升高Bax/Bcl-2比值誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。因此，本研究采用Aβ誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞建立體外神經(jīng)炎癥模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aβ1-42可劑量依賴性地降低BV-2細(xì)胞活力，這可能與其導(dǎo)致的炎癥因子大量釋放進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。

NLRP3炎性小體是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其結(jié)構(gòu)組成包括NLRP3、接頭蛋白(ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)[13-14]。當(dāng)NLRP3炎性小體被激活后可釋放Caspase-1并促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為活化形式，活化的Caspase-1將無活性的pro-IL-1β和pro-IL-18剪切成具有活性的IL-1β和IL-18，IL-1β和IL-18的過度釋放則加重炎癥反應(yīng)，對膠質(zhì)細(xì)胞周圍的神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能衰退[15]。本研究的結(jié)果表明，Aβ1-42可促進(jìn)NLRP3炎性小體的活化并導(dǎo)致IL-1β和IL-18的分泌增加，這與TERRILL-USERY等[16]的研究一致；此外，本研究的結(jié)果亦表明，Met可顯著抑制NLRP3炎性小體的活化并減少IL-1β和IL-18的分泌，說明Met抑制BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)可能與抑制NLRP3炎性小體的激活有關(guān)。NF-κB對炎癥因子、黏附分子、生長因子等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括NF-κB、NF-κB抑制蛋白(inhibitory nuclear factor-κB, IκB)和IκB激酶(IκB kinase, IKK)，IκB可通過與NF-κB結(jié)合抑制其活性，當(dāng)IκB被IKK磷酸化后失去活性，進(jìn)而釋放NF-κB使其激活，活化的NF-κB則可易位至胞核促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄[17-19]。本研究表明，Aβ1-42可通過促進(jìn)IκB磷酸化從而激活NF-κB，活化的NF-κB可促進(jìn)NLRP3的轉(zhuǎn)錄，這很可能是Aβ1-42加重BV-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的又一機(jī)制。這一結(jié)果與LIU等[20]在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的研究中得到的結(jié)果一致。Met處理后，Aβ1-42介導(dǎo)的IκB磷酸化明顯被減弱，NF-κB活性被抑制。Met對NF-κB信號(hào)的抑制作用在食管鱗癌中也得到了證實(shí)[21]。

Met作為臨床治療糖尿病的一線藥物，在長期的臨床應(yīng)用中被發(fā)現(xiàn)還具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗腫瘤等作用[6-8,22-24]。Met作為AMPK的激活劑，PAN等[8]發(fā)現(xiàn)，Met可通過激活A(yù)MPK抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，另外，由于激活A(yù)MPK信號(hào)還可增強(qiáng)自噬活性，可能有益于Aβ的清除，進(jìn)而減弱Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[25]。GE等[22]發(fā)現(xiàn)，Met可通過PI3K/Akt1/JNK3途徑抑制缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡，從而改善大鼠認(rèn)知功能。TAO等[26]發(fā)現(xiàn)，Met可通過NF-κB通路抑制創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。本研究的結(jié)果表明，0.5、1、2 mmol/L的Met可顯著抑制IκB磷酸化進(jìn)而抑制NF-κB的活性，同時(shí)還可劑量依賴性地抑制Aβ1-42對NLRP3炎性小體的活化作用，減少TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的表達(dá)與釋放，并最終發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥的作用。本研究的結(jié)果為Met抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減弱神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。不足的是，本研究僅在體外水平證實(shí)了Met抑制神經(jīng)炎癥的效果，尚缺乏體內(nèi)研究，后續(xù)將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究Met抑制神經(jīng)炎癥的體內(nèi)效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Met可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的轉(zhuǎn)錄與釋放，發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥效果，Met抑制神經(jīng)炎癥的作用與下調(diào)NF-κB信號(hào)通路抑制NLRP3炎性小體的活化有關(guān)。本研究為Met的神經(jīng)保護(hù)作用提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，將對Met治療神經(jīng)炎癥性疾病提供新的見解和依據(jù)。