李閣錦，郭維軍，曹祁峰，周鐵忠，李 冰*

（1. 錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121000；2. 錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧錦州121001）

小鵝瘟又稱鵝細(xì)小病毒病，由鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）引起4～20日齡雛鵝的一種急性或亞急性敗血癥，以發(fā)生滲出性腸炎為主要特征，傳播快、病死率高。本病最早由方定一于1956年發(fā)現(xiàn)，在我國江蘇揚(yáng)州地區(qū)流行，并首次報(bào)道該病的流行特點(diǎn)和臨診特征[1]。1961年，方定一團(tuán)隊(duì)對(duì)該病病原進(jìn)行系統(tǒng)研究，確定該病原是一種和新城疫、鴨病毒性肝炎無關(guān)的病毒，建議命名為小鵝瘟病毒[2]。1967年，匈牙利學(xué)者Derzsy利用13日齡鵝胚成功分離出小鵝瘟病毒[3]。1973年，Schettler 利用鵝胚成纖維細(xì)胞也成功分離到該病毒，病毒的理化特性與其他已知的禽類病毒不同，具備細(xì)小病毒的特征，建議將該病毒歸類為細(xì)小病毒[4]。1974年，世界家禽學(xué)會(huì)（World's Poultry Science Association，WPSA）為紀(jì)念Derzsy 對(duì)小鵝瘟研究所做出的貢獻(xiàn)，將該病命名為Derzsy's 病[5]。1979年，國際病毒分類委員會(huì)（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第3次報(bào)告將該病毒正式命名為鵝細(xì)小病毒[6]。

GPV是細(xì)小病毒科（Parvoviridae）成員，歸屬于細(xì)小病毒亞科（Parvovirinae）、依賴病毒屬（Dependovirus）、雁形目依 賴 細(xì) 小 病 毒1 型（Anseriform dependoparvovius 1）[7]。GPV為單股線狀DNA病毒，基因組全長約5 kb，編碼區(qū)依次編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2 和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3[8]，非編碼區(qū)由回文序列（inverted terminal repeats，ITR）組成位于編碼區(qū)兩側(cè)，依次為5'-ITP-VS1-VS2-VP1-VP2-VP3-ITR-3'。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 和NS2，主要是參與病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制[9]；結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3共同組成衣殼蛋白。Tullis等[10]報(bào)道，VP1蛋白在病毒感染中發(fā)揮重要作用，可以引導(dǎo)衣殼蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與宿主細(xì)胞受體結(jié)合。VP3是衣殼蛋白的主要組成部分，可占衣殼蛋白總量的80%，內(nèi)含GPV 主要抗原決定簇，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白[11]。ITR 為倒置重復(fù)序列，位于基因組的兩端，頭部可以折疊形成U型發(fā)夾結(jié)構(gòu)，ITR主要參與病毒復(fù)制與組裝的過程[12]。本研究對(duì)遼寧地區(qū)分離的鵝細(xì)小病毒進(jìn)行全基因測(cè)序，并與國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析，為遼寧地區(qū)鵝細(xì)小病毒的分子流行病學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鵝細(xì)小病毒由遼寧省錦州市疾病預(yù)防控制中心分離保存；病毒基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；2×Taq Master Mix（含染料）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA回收購自南京維諾贊生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker、pMD-18T Vector 購自寶生物工程有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒總DNA的提取

取200 μL 細(xì)胞培養(yǎng)物于滅菌1.5 mL 離心管中，用病毒基因組DNA 提取試劑盒，按照使用說明書從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取病毒總DNA后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中GPV 毒株DY16（登錄號(hào)：MH209633）設(shè)計(jì)8對(duì)引物，對(duì)分離的病毒全基因序列進(jìn)行分段擴(kuò)增，引物信息詳見表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 全基因引物序列Tab.1 Whole gene primer sequence

1.2.3 全基因序列擴(kuò)增及克隆測(cè)序

采用PCR 方法對(duì)全基因序列進(jìn)行分段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（30 μL）如 下：2×Taq Master Mix 15 μL、ddH2O 10 μL、引物2 μL、模板DNA 3 μL，按照表1 中退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，純化后產(chǎn)物連接到pMD-18T 載體上并轉(zhuǎn)入DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含氨芐西林（100 μg/mL）的LB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，過夜培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)PCR 驗(yàn)證為陽性，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，放于-20 ℃保存，將所提陽性質(zhì)粒送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增及克隆測(cè)序3 次。

1.2.4 全基因序列比對(duì)分析（見表2）

測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI-BLAST 比對(duì)正確后，采用DNAMAN 進(jìn)行各段序列拼接，獲得完整的全基因序列。采用MEGA 7.0、DNAStar 7.0將遼寧分離株鵝細(xì)小病毒全基因序列與GenBank 中公布的國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行序列 比對(duì)分析，并制作進(jìn)化樹。

表2 全基因比對(duì)代表毒株信息Tab.2 Full gene comparison representative strain information

2 結(jié)果與分析

2.1 GPV 遼寧分離株全基因各片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果（見圖1）

由圖1 可知，利用PCR 方法，成功擴(kuò)增出GPV 遼寧分離株全基因各片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段與預(yù)期片段大小基本一致。

圖1 GPV遼寧分離株全基因各片段PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of all gene fragments of GPV Liaoning isolate

2.2 GPV 遼寧地區(qū)分離株全基因序列拼接與分析（見表3）

表3 LNGPV20毒株與代表毒株各段基因序列比對(duì)Tab.3 Alignment of gene sequences between LNGPV20 strain and representative strain

采用DNAMAN 軟件，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、校正，經(jīng)BLAST 驗(yàn)證獲得GPV 遼寧分離株全基因序列，命名為LNGPV20。分離毒株基因全長5106 bp，共有兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3，ITR序列長為444 bp。由表3可知，LNGPV20毒株各段基因序列長度與歐洲標(biāo)準(zhǔn)株B 毒株各段基因序列長度一致，LNGPV20毒株的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白序列長度與DY16、RC16、HB-2019、SYG61v毒株相同，與82-0321、SQ0412、E、FJ01毒株各蛋白序列長度均存在一定差異。其中ITR 基因序列長度變化最大，序列長度在414～447 bp之間，相差33個(gè)堿基。14個(gè)毒株各段基因序列同源性為91.13%～98.00%，各基因片段核苷酸同源性較高，其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1核苷酸同源性為98.00%，同源性最高。

2.3 基于ITR序列比對(duì)分析（見圖2）

由圖2可知，GPV全基因組5'端與3'端ITR序列相同，呈末端倒置重復(fù)序列。LNGPV20 毒株ITR 由444 個(gè)堿基組成，與標(biāo)準(zhǔn)毒株B 株相比ITR 的5'端缺少一個(gè)堿基C，ITR外側(cè)405個(gè)堿基形成一個(gè)U型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由181個(gè)堿基對(duì)形成的“莖部”和43個(gè)堿基形成的“泡區(qū)”構(gòu)成，“泡區(qū)”197～202 陰影區(qū)為SphⅠ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。ITR 內(nèi)側(cè)有39 個(gè)堿基，不參與U 型發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，但全基因組5'端與3'端ITR內(nèi)側(cè)的39個(gè)堿基呈反向互補(bǔ)，不影響基因組形成回文結(jié)構(gòu)。LNGPV20毒株與B毒株相比，在181個(gè)堿基對(duì)區(qū)域存在20個(gè)堿基的差異，但不影響互補(bǔ)配對(duì)。

圖2 LNGPV20毒株5'端ITR序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.25'ITR sequence and secondary structure of LNGPV20 strain

2.4 LNGPV20毒株全基因序列比對(duì)分析（見圖3）

由圖3 可知，采用DNAstar 軟件Jotun Hein 方法對(duì)LNGPV20 毒株與已公布于GenBank 的14 個(gè)代表毒株進(jìn)行基因序列的同源性分析，LNGPV20 毒株與14 個(gè)毒株全基因序列同源性在93.2%～98.9%之間，同源性均在90%以上。由此可見，鵝細(xì)小病毒全基因序列變化差異不大，比較保守。LNGPV20毒株與DY16、RC16毒株同源性最高，均為98.9%；與標(biāo)準(zhǔn)毒株B 株同源性為96.6%，而與GDaGPV、GPV-98E、SYG61v 疫苗毒株同源性較低，分別為93.2%、93.4%、93.5%。

2.5 基于全基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析（見圖4）

由圖4可知，采用MEGA7.0軟件，根據(jù)LNGPV20毒株與已公布于GenBank的20個(gè)參考毒株基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹顯示鵝細(xì)小病毒的分離株與番鴨細(xì)小病毒的分離株分別處于兩大遺傳分支上，鵝細(xì)小病毒的疫苗株與野毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于兩個(gè)小分支內(nèi)。LNGPV20 毒株與DY16、RC16、HB-2019、SQ0412 毒株親緣關(guān)系較近，與標(biāo)準(zhǔn)毒株B株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)處于不同分支內(nèi)。由此可見，國內(nèi)流行的鵝細(xì)小病毒基因組變異不明顯，同源性較高，親緣關(guān)系較近。

圖3 LNGPV20毒株核苷酸比對(duì)分析Fig.3 Nucleotide comparison analysis of LNGPV20 strain

圖4 20株GPV全基因進(jìn)化樹Fig.420 GPV whole gene evolutionary trees

3 討論

在細(xì)小病毒科所有成員中，GPV、MDPV 與人細(xì)小病毒AAV-2 親緣關(guān)系最近。但AAV-2 只有與腺病毒或皰疹病毒等輔助病毒共同感染時(shí)，才能進(jìn)行病毒復(fù)制[11]。而GPV和MDPV不需要輔助病毒，主要通過內(nèi)吞途徑將衣殼蛋白帶入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，將病毒DNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，進(jìn)行DNA 復(fù)制[13]。GPV 的基因組比MDPV 的基因組短，GPV 的ITR 在414～447 之間，MDPV 的ITR 在421～457之間。由此可知，GPV、MDPV 的ITR 長度差異較大[14]。LNGPV20 毒株基因組全長5106 bp，ITR 序列長444 bp，ITR內(nèi)側(cè)有39個(gè)堿基不參與ITR的U型發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，而B 株ITR 內(nèi)側(cè)有38 個(gè)堿基不參與ITR 的U 型發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成，可能與LNGPV20毒株ITR的5'端缺少一個(gè)堿基C有關(guān)。有研究表明，ITR 的長度，是影響毒株毒力的關(guān)鍵[15]，但宋娜[16]對(duì)2 株江蘇省鵝細(xì)小病毒分離株，ITR 分別為416 bp 和444 bp，且毒力均較強(qiáng)，因此推斷GPV 的毒力強(qiáng)弱并不能依據(jù)ITR 的長度來判斷。各毒株結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白同源性在97.64%～98.00%之間，相對(duì)于ITR 差異不大。近年來，學(xué)者對(duì)GPV非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位區(qū)進(jìn)行定位分析[17]，經(jīng)郭鷺等[18]、黎明等[19]對(duì)GPV 結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行抗原表位的精準(zhǔn)定位，抗原表位為VP3 蛋白430～435 aa 和643～647 aa、NS1 蛋白503～509 aa，為疫苗制備、特異性抗體制備等奠定理論基礎(chǔ)。

遼寧分離毒株與14 個(gè)毒株全基因序列同源性比對(duì)分析，與GDaGPV、GPV-98E、SYG61v 疫苗毒同源性均在93%以上，除去ITR 序列，疫苗株與國內(nèi)11 個(gè)野毒株的NS、NP 蛋白同源性均在97%以上，由于疫苗株與野毒株NS、NP同源性較高，且大部分抗原決定簇集中分布于NS、NP 蛋白[20]，可見國內(nèi)小鵝瘟疫苗對(duì)小鵝瘟應(yīng)有較高的保護(hù)率，但由于養(yǎng)鵝業(yè)飼養(yǎng)環(huán)境的差異，導(dǎo)致母源抗體參差不齊，大多數(shù)種鵝未進(jìn)行免疫接種且呈隱性感染，雖然無發(fā)病癥狀，但仍可以散播病毒，導(dǎo)致小鵝瘟對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害越來越嚴(yán)重[21]。另外，遼寧分離株與國內(nèi)野毒株同源性在96.6%～98.9%之間，其中有4 個(gè)病毒株同源性在98%以上，分別源于安徽、重慶、河北、山東。由此可見，國內(nèi)流行的鵝細(xì)小病毒基因組變異不明顯，同源性較高，可能是近年來養(yǎng)鵝業(yè)迅速發(fā)展，鵝苗流通增加，交叉感染所致。

4 結(jié)論

本研究采用PCR 方法對(duì)鵝細(xì)小病毒全基因分段進(jìn)行擴(kuò)增，首次獲得遼寧分離株全基因序列，該研究結(jié)果進(jìn)一步豐富我國鵝細(xì)小病毒基因數(shù)據(jù)庫，同時(shí)也為遼寧省鵝細(xì)小病毒的防控提供參考。