蔡思學(xué)，戶晶晶，孫樂常，王瑞芳，王 力

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門361021）

抗氧化劑在日常生活中是必不可少的一部分[1]，在食品工業(yè)中保護(hù)食品免受氧化，改善食品質(zhì)量，延長(zhǎng)貨架期。在生物醫(yī)學(xué)中，抗氧化劑生物學(xué)研究具有較好的成效，作為抗癌劑、保肝劑[2]，以及治療類風(fēng)濕、心血管疾病、細(xì)菌感染等[3]中發(fā)揮特定的作用。另外，氧化應(yīng)激參與糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，使用抗氧化劑可減少氧化應(yīng)激，并減輕糖尿病并發(fā)癥[4-5]?？寡趸瘎┰诨瘖y品，治療行業(yè)中的也有廣泛應(yīng)用[6]。

植酸是一種重要的有機(jī)磷天然抗氧化劑，廣泛存在于谷類和植物種子中。植酸作為抗氧化劑的應(yīng)用型研究報(bào)道越來(lái)越多[7]。Mu?oz 等[8]研究報(bào)道天然的磷化合物植酸，可作為尿石癥的潛在抑制劑。Lv 等[9]研究發(fā)現(xiàn)植酸在帕金森病治療中起到一定的作用，顯著抑制MPTP 誘導(dǎo)的黑質(zhì)（SN）多巴胺能細(xì)胞損失，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）。Thompson 等[10]研究證實(shí)了添加內(nèi)源植酸對(duì)減緩淀粉消化率和對(duì)豆科植物的血糖反應(yīng)能力有影響?？箟难嶙貦八狨ナ且环N通過(guò)化合物合成的被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限定的抗氧化劑，已被藥品管理局（FDA）提議作為美國(guó)安全食品和天然二級(jí)食品抗氧化劑。抗壞血酸棕櫚酸酯具有抗氧化活性，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[11-12]，其表現(xiàn)出生物活性，可用于治療腫瘤等多種疾病[13]。Fathi 等[14]利用表面等離子共振技術(shù)研究牛血清白蛋白與抗壞血酸棕櫚酸酯之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們之間的結(jié)合會(huì)影響蛋白的構(gòu)象，從而可能干擾生物活性分子在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布。Zhou 等[15]研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸棕櫚酸酯可用于協(xié)同抗腫瘤治療。

糖尿病是一種伴隨代謝和內(nèi)分泌紊亂的重大疾病。大多數(shù)糖尿病患者受到胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷的2 型糖尿?。═2DM）的影響，并出現(xiàn)各種并發(fā)癥，包括大血管和微血管功能障礙等[16-17]。通常治療T2DM 的策略是飲食控制，適度運(yùn)動(dòng)，使用降血糖和降脂劑等[18]。抑制α-葡萄糖苷酶是治療糖尿病的手段之一，有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性可減緩餐后血糖水平的提高。Kunyanga 等[19]研究表明植酸含量高的植物可有效抑制食品樣品中α-葡萄糖苷酶的活性，其抑制程度與植酸含量直接相關(guān)，而植酸含量可能對(duì)餐后血糖水平的潛在治療有協(xié)同作用。然而，植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯2 種抗氧化劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理未見報(bào)道。本研究通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)研究植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為這2 種抗氧化劑功能性研究提供新思路，同時(shí)為開發(fā)新型酶抑制劑用于治療糖尿病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

釀酒酵母的α-葡糖苷酶（EC 3.2.1.20），美國(guó)Singma-Aidrich 公司；阿卡波糖，上海麥克萊恩生化科技有限公司；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、對(duì)硝基苯（pNP），北京百靈威科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉（Na2CO3），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植酸、L-抗壞血酸棕櫚酸酯，上海陸廣生物科技有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

Synergy H1 全功能酶標(biāo)記儀器，美國(guó)BioTek儀器有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴，上海恒世儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡糖苷酶的抑制效果

α-葡萄糖苷酶能使pNPG 水解生成pNP，生成物在紫外吸收波長(zhǎng)405 nm 處具有最大吸收值。化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果測(cè)定方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)一步修改。α-葡萄糖苷酶的測(cè)活總體系為340 μL，首先加入133 μL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合配制而成，pH 6.8），加入10 μL 5 U/mL α-葡萄糖苷酶稀釋液，隨后加入7 μL 不同濃度梯度的效應(yīng)物溶液，混合均勻后在37 ℃下孵育10 min。加入20 μL 5 mmol/L 底物pNPG 溶液，混合均勻后在37℃下孵育20 min。170 μL 0.1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。取200 μL 混合液于96 孔板中，采用Synergy H1 全功能酶標(biāo)記儀器在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)得吸收值。

待測(cè)效應(yīng)物為植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯，植酸濃度依次為0.15，0.16，0.17，0.18，0.19，0.20，0.205，0.21，0.215，0.220，0.230 mol/L，L-抗壞血酸棕櫚酸酯濃度依次為0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6 mmol/L，每個(gè)梯度下平行測(cè)定5 次，得到不同效應(yīng)物濃度下最后反應(yīng)體系的吸收值。以α-葡萄糖苷酶剩余酶活的抑制率降低至50%時(shí)效應(yīng)物的濃度為即為IC50值。將沒有效應(yīng)物的反應(yīng)作為空白對(duì)照組。

2.2 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡糖苷酶的抑制機(jī)理

待測(cè)效應(yīng)物為植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯，效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的研究是基于抑制效果的測(cè)定方法。α-葡萄糖苷酶的濃度梯度為5，4，3，2，1 U/mL，底物pNPG 濃度為5 mmol/L，測(cè)定效應(yīng)物在不同濃度下反應(yīng)體系的紫外吸收波長(zhǎng)。以酶的濃度梯度為橫坐標(biāo)，體系的反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)繪制機(jī)理圖，通過(guò)圖中曲線是否過(guò)原點(diǎn)來(lái)判定效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理。

2.3 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡糖苷酶的抑制類型

待測(cè)效應(yīng)物為植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯，效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型的研究是基于抑制效果的測(cè)定方法。α-葡萄糖苷酶的濃度為5 U/mL，底物pNPG 的濃度梯度為5，3.9，2.8，1.7，1.1 mmol/L，測(cè)定效應(yīng)物在不同濃度下反應(yīng)體系的紫外吸收波長(zhǎng)。以pNPG 濃度梯度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，體系的反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk 類型圖，圖中曲線的交點(diǎn)位置判定效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型。通過(guò)二次作Dixon 圖，計(jì)算抑制常數(shù)。

2.4 分子對(duì)接技術(shù)

分子對(duì)接技術(shù)可以進(jìn)一步探索效應(yīng)物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合模式。PubChem 中下載植酸和L-抗壞血酸棕櫚棕櫚酸酯的2D 結(jié)構(gòu)保存為SDF格式。通過(guò)Chem3D Pro 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)保存為mol2 格式。UniProt 蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)（http：//www.uniprot.org/）檢索釀酒酵母α-葡糖苷酶的一級(jí)序列，訪問代碼為P53341。選擇與靶標(biāo)具有72.4%序列同一性的釀酒酵母異麥芽糖酶（PDB編碼3AJ7，1.38? 分辨率）的晶體結(jié)構(gòu)作為建模模板[21]。使用Molecular Operating Environment（MOE）同源構(gòu)建模型工具構(gòu)建釀酒酵母α-葡糖苷酶的3D 結(jié)構(gòu)。將酶蛋白和效應(yīng)物能量最小化至0.05 RMS 梯度便于兩者對(duì)接。構(gòu)建的配體化合物和酶蛋白導(dǎo)入MOE 軟件中同一窗口，通過(guò)Simulationdock 將酶和配體進(jìn)行半柔性對(duì)接。對(duì)于每個(gè)配體，配體分子通過(guò)姿勢(shì)的扭轉(zhuǎn)形成多種構(gòu)象，盡可能穩(wěn)定的構(gòu)象與酶活性口袋結(jié)合。篩選出最好配體構(gòu)象與酶蛋白活性位點(diǎn)氨基酸殘基的結(jié)合模式和相互作用，并使用可視化工具PyMol 程序顯示兩者結(jié)合的三維圖像[22]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用Origin Pro 8.5 軟件繪制圖形與分析。使用Chem3D Pro 軟件轉(zhuǎn)化3D 結(jié)構(gòu)，使用Molecular Operating Environment（MOE）軟件進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMol 軟件觀察對(duì)接結(jié)果的結(jié)合模式。所有數(shù)據(jù)值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”。

3 結(jié)果與分析

3.1 效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制效果。效應(yīng)物對(duì)酶的相對(duì)剩余酶活的抑制率隨著效應(yīng)物濃度的增加而降低，當(dāng)植酸濃度達(dá)到0.195 mol/L 時(shí)，抑制率降低為71%，當(dāng)抑制率降低到50%時(shí)，植酸的濃度（IC50）為（0.207±3.137）mol/L。L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制酶活達(dá)到50%時(shí)，濃度為（0.39±0.00838）mmol/L。就IC50而言，L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于植酸?？赡苁怯捎贚-抗壞血酸棕櫚酸酯頭部帶有酚羥基的苯基更容易與α-葡萄糖苷酶結(jié)合。阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制率IC50為658 mmol/L，植酸的抑制效果沒有阿卡波糖的效果好，然而L-抗壞血酸棕櫚酸酯的抑制效果是阿卡波糖的上千倍。

3.2 效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理

植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理如圖1所示。圖中的曲線均交于原點(diǎn)，直線斜率分別隨效應(yīng)物濃度升高而降低。因此，2種效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶均為可逆性抑制，效應(yīng)物與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合成可解離的復(fù)合物[23]。在該酶活體系的測(cè)定中雖然酶催化反應(yīng)速率降低，但是沒有減少有效酶量。

圖1 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理Fig.1 Determination of the inhibitory mechanism of phytic acid and L-ascorbyl palmitate on α-glucosidase

3.3 效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型

植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型如圖2所示。圖2a 所示，植酸的Lineweaver-Burk 圖中直線1～4 相交于第Ⅱ象限，隨著植酸濃度升高，米氏常數(shù)（Km）變大，最大反應(yīng)速率（Vmax）降低，表明效應(yīng)物植酸對(duì)α-葡萄糖苷酶是混合型抑制，具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制2 種途徑[24]。植酸既能與游離的酶結(jié)合，也能與酶-底物復(fù)合物結(jié)合。通過(guò)繪制Dixon 圖計(jì)算抑制常數(shù)KI和KIS分別為KI=0.117 mol/L 和KIS=0.163 mol/L。由KI值小于KIS值，表明化合物與α-葡萄糖苷酶結(jié)合之外，主要形成ESI （效應(yīng)物-酶-底物）復(fù)合物。

L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型如圖2b 所示，直線1～4 相交于第Ⅰ象限，非常接近Y 軸，隨著L-抗壞血酸棕櫚酸酯濃度升高，米氏常數(shù)（Km）變大，最大反應(yīng)速率（Vmax）不變（變化輕微）[25]，表明L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶是競(jìng)爭(zhēng)型抑制，主要是與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，抑制常數(shù)KI=0.202 mmol/L。

圖2 植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型及抑制常數(shù)Fig.2 Determination of the inhibitory type and inhibition constant of phytic acid and L-ascorbyl palmitate on α-glucosidase

3.4 分子對(duì)接結(jié)果

植酸與α-葡萄糖苷酶活性口袋的氨基酸殘基相互作用如圖3所示。如圖3a 所示，植酸進(jìn)入葡萄糖苷酶的活性口袋中，活性口袋周圍重要的氨基酸 Phe303，Phe159，Val216，Leu219，Phe178是疏水性氨基酸，與活性口袋的形成有關(guān)，這與植酸進(jìn)入活性口袋也有一定的影響。如圖3b，3c 所示，植酸分子帶有6 個(gè)磷酸根離子，所帶的陰離子有利于與活性口袋周圍帶正電荷的氨基酸殘基相互作用。配體分子植酸與α-葡萄糖苷酶活性口袋氨基酸殘基Arg315，Arg442，Gln279 形成氫鍵。氫鍵是植酸與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的關(guān)鍵作用[26]。此外，植酸與氨基酸殘基Glu411，Gln353，Asp307，Glu277，Asp352，His351，Thr306，His280，Asn350，Tyr72，Tyr158 形成范德華力，形成的非共價(jià)鍵作用力（氫鍵和范德華力），在穩(wěn)定植酸與α-葡萄糖苷酶復(fù)合物中起主要作用[27]。

圖3 植酸與α-葡萄糖苷酶活性口袋的氨基酸殘基相互作用Fig.3 Interaction of phytic acid with amino acid residues in the activity pocket of α-glucosidase

L-抗壞血酸棕櫚酸酯與α-葡萄糖苷酶活性口袋的氨基酸殘基相互作用如圖4所示。由圖4b，4c 可以看出，L-抗壞血酸棕櫚酸酯的分子結(jié)構(gòu)，一端為帶有酚羥基的苯環(huán)，隨后相連接的是較長(zhǎng)碳鏈結(jié)構(gòu)[28]。帶有酚羥基苯環(huán)一端進(jìn)入酶的活性口袋朝向氨基酸殘基His315，Arg442，Arg446，Asp69，并與4 個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵。氫鍵形成的越多，配體分子與酶結(jié)合越穩(wěn)定。整個(gè)配體分子進(jìn)入酶的活性口袋中，由于碳鏈較長(zhǎng)，進(jìn)入活性口袋需要扭轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)變姿勢(shì)及克服空間阻礙而消耗更多的能量。此外，配體分子L-抗壞血酸棕櫚酸酯的尾部朝向Phe303，Phe159，Val216，Phe178 疏水性氨基酸，形成疏水相互作用。配體分子L-抗壞血酸棕櫚酸酯與周圍的氨基酸殘基Tyr72，Gln279，Tyr158，Asp352，Asn350，Tyr347，Thr306，Glu277，Arg315，Glu411 形成范德華力。L-抗壞血酸棕櫚酸酯與α-葡萄糖苷酶的活性口袋周圍的氨基酸非常穩(wěn)定的結(jié)合。

圖4 L-抗壞血酸棕櫚酸酯與α-葡萄糖苷酶活性口袋的氨基酸殘基相互作用Fig.4 Interaction of L-ascorbyl palmitate with amino acid residues in the activity pocket of α-glucosidase

4 結(jié)論

抗氧化劑植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制效果。植酸對(duì)α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度為（0.207±3.137）mol/L，抑制類型表現(xiàn)為可逆混合型抑制。L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值為 （0.39±0.00838）mmol/L，抑制類型為可逆競(jìng)爭(zhēng)型抑制。植酸和L-抗壞血酸棕櫚酸酯分別與α-葡萄糖苷酶活性口袋的氨基酸殘基相互作用，形成氫鍵，疏水相互作用，范德華力等非共價(jià)相互作用。此結(jié)果與酶動(dòng)力學(xué)的抑制機(jī)理的研究結(jié)果具有一致性。此外，針對(duì)2 種抗氧化劑對(duì)酶的抑制效果，與限定的添加量進(jìn)行比較，L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出高效性，在作為α-葡萄糖苷酶抑制劑提供理論依據(jù)的同時(shí)，也為L(zhǎng)-抗壞血酸棕櫚酸酯的功能性應(yīng)用提供了理論支撐。