朱光勝 李永文 施睿峰 徐松林 張子禾 曹培俊 陳琛 劉紅雨 陳軍

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的最常見原因，每年有超過一百萬人死于肺癌[1]。根據(jù)組織學(xué)類型不同，肺癌分為兩個(gè)主要亞型：非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）分別占所有病例的85%和15%[2]。肺腺癌是最常見的NSCLC，近年來，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR‐TKIs），顯著改善EGFR陽性突變的肺腺癌患者的無進(jìn)展生存期（progression‐free survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）[3]。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor, ICI）的使用是近年來肺癌治療的又一項(xiàng)重大突破。已有的數(shù)據(jù)表明，在程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD‐L1）表達(dá)陽性的肺癌患者中，ICI單藥或聯(lián)合化療的療效，超過了化療藥。因此，依據(jù)PD‐L1表達(dá)水平的不同，ICI單藥或ICI聯(lián)合化療已經(jīng)成為肺癌患者的一線治療選擇方案。另一方面，在具有EGFR突變的肺腺癌患者中，ICIs的治療效果普遍不佳。比如最近的一項(xiàng)臨床研究探索了EGFR突變的肺癌患者一線使用ICIs的效果。這項(xiàng)II期單臂試驗(yàn)對PD‐L1表達(dá)≥1%的EGFR突變NSCLC患者進(jìn)行每3周靜脈注射200 mg派姆單抗（Pembrolizumab）治療，在11例患者接受治療后，由于缺乏療效而該研究提前結(jié)束，客觀緩解率（objective response rate, ORR）為0%，結(jié)果令人十分失望[4]，而產(chǎn)生如此結(jié)果的機(jī)制尚不明確，推測與兩類患者不同的免疫微環(huán)境有關(guān)。因此，最新的美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）臨床指南及中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學(xué)協(xié)作中心（Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO）臨床指南均指出，EGFR突變陽性肺腺癌患者首選的治療方案是EGFR‐TKI；對驅(qū)動基因突變陰性、PD‐1表達(dá)陽性患者，ICI單藥或ICI聯(lián)合化療可以成為一線治療方案。

癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）作為目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，包含了臨床樣本數(shù)據(jù)以及多組學(xué)的數(shù)據(jù)，其中包含了包括基因表達(dá)數(shù)據(jù)、拷貝數(shù)變異、DNA甲基化、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）的數(shù)據(jù)。

本研究擬通過TCGA公共數(shù)據(jù)集，在分析研究EGFR突變肺腺癌患者與野生型肺腺癌患者的臨床特征差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析其免疫微環(huán)境水平的差異，初步探討EGFR突變肺腺癌患者與野生型肺腺癌患者在接受ICIs治療時(shí)產(chǎn)生的不同治療效果的可能的發(fā)生機(jī)制，為未來可能的治療方案提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集 從TCGA數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載566例肺腺癌患者的臨床資料、單核苷酸改變的數(shù)據(jù)以及RNA‐seq的信息。通過Cbioportal在線數(shù)據(jù)庫（http://www.cbioportal.org/）獲得了肺腺癌腫瘤突變分布圖（圖1）。

圖1 肺腺癌患者基因突變分布圖Fig 1 Oncoplot of lung adenocarcinoma

1.2 數(shù)據(jù)集篩選 根據(jù)單核苷酸改變的數(shù)據(jù)，利用樣本中是否出現(xiàn)EGFR突變的信息進(jìn)行篩選，僅保留501例TCGA數(shù)據(jù)集中包含EGFR突變的信息和對應(yīng)的RNA‐seq的病例。并將其通過EGFR是否突變分為EGFR突變組與野生型組。

1.3 免疫相關(guān)淋巴細(xì)胞浸潤計(jì)算 通過TIMER 2.0（http://timer.comp‐genomics.org/）獲得通過四種方法（CIBERSORT, CIBERSORT ABS, QUANTISEQ, XCELL）[5]計(jì)算得出的TCGA數(shù)據(jù)庫中免疫相關(guān)淋巴細(xì)胞浸潤結(jié)果。

1.4 功能富集分析 利用R語言“cluster Profiler”程序包對野生型組和EGFR突變組進(jìn)行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床信息相關(guān)性分析，組間比較采用卡方檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，采用乘積極限法（Kaplan-Meier）繪制生存曲線、對數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-rank）比較不同樣本的生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR野生型和突變型肺腺癌患者的相關(guān)臨床資料分析 本研究從TCGA數(shù)據(jù)集下載、整理、分析了501例肺腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)和其對應(yīng)的信息，其中，男性232例（46%），女性269例（54%），中位年齡65歲；存在吸煙史的407例（81%），無吸煙史的67例（13%），27例患者的吸煙史未被提及；EGFR突變型67例（13%），EGFR野生型434例（87%）。如表1所示，EGFR突變型和野生型肺腺癌患者在年齡、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而EGFR突變型較野生型肺腺癌更頻繁發(fā)生于女性患者（突變型女性：n=48，72%；野生型女性：n=221，51%）（P=0.003）；EGFR突變型較野生型肺腺癌更頻繁發(fā)生于從未吸煙患者（突變型從未吸煙患者：n=24，36%；野生型從未吸煙患者：n=43，10%）（P<0.001）。進(jìn)一步采用Kaplan-MeierPlotter方法分析EGFR突變型與野生型肺腺癌患者的生存差異，如圖2所示，二者在生存時(shí)間上未見顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Log-rank檢驗(yàn)，P=0.22，圖2）。

圖2 EGFR是否突變與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig 2 The relationship between EGFR mutation and prognosis of patients with lung adenocarcinoma

表1 EGFR野生型和突變型肺腺癌患者的相關(guān)臨床資料分析Tab 1 Analysis of clinical data of patients with EGFR-mutation and EGFR-wild lung adenocarcinoma

2.2 EGFR野生型組和EGFR突變組患者肺癌組織免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤水平分析 本研究通過XCELL法計(jì)算獲得樣本的免疫相關(guān)淋巴浸潤情況，使用R語言的“ggplot2”程序包分析了在EGFR突變型與野生型肺腺癌患者之中，免疫相關(guān)淋巴浸潤情況的差異。我們發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者趨于具有更高的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、普通髓系祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、效應(yīng)CD4+T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞浸潤；更低的記憶B細(xì)胞、初始B細(xì)胞、漿細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、記憶CD4+T細(xì)胞、CD4+輔助性T細(xì)胞2、CD8+T細(xì)胞、中心記憶CD8+T細(xì)胞、初始CD8+T細(xì)胞浸潤（圖3A）。我們對67例EGFR突變患者的樣本中細(xì)胞浸潤情況做了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)除造血干細(xì)胞（P<0.05）、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（P<0.05）、內(nèi)皮細(xì)胞之間互相具有較強(qiáng)的相關(guān)性（P<0.05），各免疫細(xì)胞浸潤之間相關(guān)性不大（圖3B）。另外，已經(jīng)有研究證明較低的CD8+T細(xì)胞與較差的免疫治療的療效是相關(guān)的[6]。同時(shí)，CD8+T細(xì)胞是ICIs治療的直接效應(yīng)細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞浸潤高低將直接影響ICIs治療對腫瘤細(xì)胞所帶來的細(xì)胞毒性效應(yīng)的高低。因此，本研究采用其他三種計(jì)算免疫浸潤的方法驗(yàn)證了CD8+T細(xì)胞浸潤在EGFR突變型與野生型之間的差異，證實(shí)了EGFR突變型患者具有較低的CD8+T細(xì)胞浸潤（圖4）。結(jié)果顯示，這可能是EGFR突變患者免疫治療療效差的因素之一。與此同時(shí)通過腫瘤突變分布圖，我們發(fā)現(xiàn)EGFR野生型患者中KRAS基因突變比例較高（圖1）。

圖3 EGFR突變肺腺癌患者免疫微環(huán)境改變。A: 野生型組和EGFR突變組免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤水平的差異；B：對67例EGFR突變型肺腺癌患者免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性分析。Fig 3 Changes of immune microenvironment in lung adenocarcinoma patients with EGFR mutation. A: differences in the infiltration levels of immune related cells between the wild-type group and the EGFR mutation group; B: Correlation analysis of the degree of immune related cell infiltration in 67 patients with EGFR mutant lung adenocarcinoma.

圖4 使用四種方法評估野生型組和EGFR突變組CD8+ T細(xì)胞浸潤程度Fig 4 Four methods were used to assess the degree of CD8+ T-cell infiltration in the wild-type group and the EGFR mutant group

2.3 免疫細(xì)胞浸潤程度與生存預(yù)后分析 為了探索免疫細(xì)胞浸潤程度與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，我們采用Kaplan-MeierPlotter方法分析各種在EGFR突變型與野生型浸潤存在差異的免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤高低與生存預(yù)后的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)在肺腺癌患者中，CD8+T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和造血干細(xì)胞在腫瘤中浸潤的程度越高則患者預(yù)后越好（Log-rank檢驗(yàn)，P=0.017、0.009,3、0.018和0.016） （圖5A、5B、5D、5E）。而CD4+輔助性T細(xì)胞2在腫瘤中浸潤的程度越高則患者預(yù)后越差（Log-rank檢驗(yàn)，P=0.016）（圖5C）。這與往期的研究結(jié)果是類似的[7]，CD8+T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞等有助于腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞浸潤增多與患者較好的預(yù)后密切相關(guān)，而CD4+輔助性T細(xì)胞2這種免疫抑制細(xì)胞對患者預(yù)后不利。

圖5 EGFR突變型與野生型浸潤程度存在差異的免疫相關(guān)細(xì)胞與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig 5 Immune related cells differentially infiltrating EGFR mutant versus wild type correlate with prognosis in lung adenocarcinoma patients

2.4EGFR突變型和野生型肺腺癌患者基因集富集通路分析 為了分析EGFR突變型和野生型肺腺癌患者在免疫相關(guān)通路上的改變，本研究采用R語言“clusterProfiler”程序包對野生型組和EGFR突變組進(jìn)行基因集富集分析。結(jié)果顯示，EGFR突變組相對于野生型組，在免疫相關(guān)的通路上除了參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子分泌的正調(diào)節(jié)（positive regulation of cytokine secretion involved in immune response）通路中的關(guān)鍵基因?yàn)樯险{(diào)外，在自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的正調(diào)控（positive regulation of natural killer cell mediated immune response to tumor cell）、自然殺傷細(xì)胞激活參與免疫反應(yīng)（natural killer cell activation involved in immune response）、在自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答（natural killer cell mediated immune response to tumor cell）這三條與自然殺傷細(xì)胞有關(guān)的通路上的關(guān)鍵基因均處于下調(diào)狀態(tài)（圖6）。

圖6 EGFR突變型和野生型肺腺癌患者基因集富集通路分析Fig 6 Gene set enrichment pathway analysis of EGFR mutant and wild type lung adenocarcinoma patients

3 討論

肺癌是中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[8]，其中NSCLC占85%[2]。在NSCLC中，肺腺癌占據(jù)了很大的比重。對于存在EGFR敏感突變的晚期肺腺癌患者來說，臨床指南建議EGFR‐TKIs作為一線用藥[9‐11]。而ICIs已經(jīng)展現(xiàn)出能使NSCLC患者長期獲益的能力，并具有較輕的副作用的特點(diǎn)。臨床前研究表明，EGFR激活可上調(diào)腫瘤細(xì)胞PD‐L1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，促進(jìn)EGFR突變NSCLC的免疫逃逸。然而，一些臨床研究已經(jīng)證明PD‐1抑制劑治療EGFR突變的NSCLC患者的療效可能很差[12,13]。本研究主要探討了EGFR突變型與野生型患者腫瘤免疫浸潤的改變，以探討EGFR突變型患者接受ICIs時(shí)效果差的潛在機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型肺腺癌患者相比，EGFR突變型患者的腫瘤的CD8+T細(xì)胞浸潤程度較低。這可能與EGFR野生型患者中KRAS基因突變比例較高有關(guān)（圖3）。而較低的CD8+T細(xì)胞與較差的免疫治療的療效是相關(guān)的[6]。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)較低的CD8+T細(xì)胞浸潤與腫瘤患者更差的預(yù)后是存在聯(lián)系的（圖5A）。并且，我們使用了四種方法計(jì)算CD8+T細(xì)胞浸潤程度，其最后結(jié)果都提示EGFR突變型患者腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞程度較低。這證明了該結(jié)論的可靠性。CD8+T細(xì)胞的數(shù)量與多種腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，并且，如果這些細(xì)胞在腫瘤里的浸潤水平低于2.2%，那么患者在手術(shù)后出現(xiàn)疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)要高出4倍[7]。因此較低的CD8+T細(xì)胞浸潤也可能是EGFR突變型肺腺癌患者接受ICIs治療時(shí)療效差的潛在原因。

同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)EGFR突變型患者腫瘤的自然殺傷T細(xì)胞浸潤程度較高（圖2A），并且較高的自然殺傷T細(xì)胞與較好的臨床預(yù)后存在聯(lián)系（圖5B）。然后在基因集富集分析的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)了三條與自然殺傷細(xì)胞相關(guān)的通路在EGFR突變患者出現(xiàn)了下調(diào)現(xiàn)象。包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的正調(diào)控、自然殺傷細(xì)胞激活參與免疫反應(yīng)、在自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答這三條在自然殺傷細(xì)胞發(fā)揮作用時(shí)起到關(guān)鍵作用的通路都下調(diào)。同時(shí)EGFR突變患者記憶B細(xì)胞、造血干細(xì)胞在腫瘤中浸潤的程度較低（圖2A），而較低的記憶B細(xì)胞、造血干細(xì)胞浸潤意味著較差的預(yù)后（圖5）。EGFR突變患者還具有較高的CD4+輔助T細(xì)胞2 （Th2 T細(xì)胞浸潤） （圖2A），然而高浸潤的Th2 T細(xì)胞往往意味著較差的預(yù)后（圖5C）。Th2細(xì)胞主要分泌白介素4（interleukin‐4, IL‐4）、IL‐5、IL‐10、IL‐13等，它主導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，輔助抗體生成[14]。近來研究[15,16]發(fā)現(xiàn)腫瘤組織多分泌Th2類細(xì)胞因子，并認(rèn)為機(jī)體處于Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢狀態(tài)是腫瘤免疫逃逸的機(jī)理之一。而記憶B細(xì)胞與造血干細(xì)胞浸潤在腫瘤免疫反應(yīng)中的作用還不明確。但這些細(xì)胞的浸潤程度與肺腺癌患者預(yù)后較好存在相關(guān)性，因此這兩種細(xì)胞的缺乏也可能是EGFR突變患者對ICIs治療不敏感的潛在原因。

綜上所述，本研究利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫，對EGFR突變型以及野生型患者的免疫微環(huán)境的差異進(jìn)行了分析，初步探索EGFR突變型患者對ICIs治療獲益較差的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)EGFR突變型患者腫瘤中CD8+T細(xì)胞浸潤較低，CD8+T細(xì)胞作為ICIs的直接效應(yīng)細(xì)胞，其浸潤過低可能是導(dǎo)致EGFR突變型患者免疫治療療效差的直接原因。同時(shí)EGFR突變型患者腫瘤中還存在記憶B細(xì)胞與造血干細(xì)胞低浸潤，Th2 T細(xì)胞高浸潤。同時(shí)在EGFR突變型患者腫瘤中高浸潤的自然殺傷細(xì)胞出現(xiàn)了功能失調(diào)。

Author contributions

Zhu GS, Shi RF and Xu SL conceived and designed the study. Shi RF, Zhang ZH and Cao PJ collected the data. Zhu GS, Xu SL and Chen C analyzed the data. Shi RF contributed analysis tools. Liu HY, Chen J and Li YW provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.