孫楠 黃傳峰 張文新 黃杰 曲守方

腫瘤突變負(fù)荷（tumour mutation burden，TMB）是指特定基因組區(qū)域每百萬堿基（Mb）的體細(xì)胞突變數(shù)目，包括點(diǎn)突變和插入缺失。隨著對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫抵抗等機(jī)制的研究不斷深入，免疫治療被迅速引入到腫瘤的臨床治療實(shí)踐中。腫瘤突變負(fù)荷作為新的潛在的生物標(biāo)記物，可以用來預(yù)測(cè)細(xì)胞程序性死亡受體1/程序性死亡配體1（Programmed cell death-1/Programmed cell death-ligand 1，PD-1/PD-L1）抑制劑的治療作用，能更好地區(qū)分免疫治療的獲益人群［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌和有錯(cuò)配修復(fù)缺陷的結(jié)直腸癌患者中，較高的TMB 與更好的總體存活率相關(guān)［3-4］。

目前TMB 的檢測(cè)方法主要為全外顯子（Whole Exome Sequencing，WES）測(cè)序和試劑盒（Panel）靶向測(cè)序［5-6］，而WES 是公認(rèn)的TMB 檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。試劑盒（Panel）靶向測(cè)序方法存在一定挑戰(zhàn)，隨著檢測(cè)平臺(tái)不同（Illumina 平臺(tái)、Proton 平臺(tái)及華大BGI 平臺(tái)），各家試劑盒所檢測(cè)的靶向基因不同，其臨界值（Cut-off 值）也會(huì)出現(xiàn)差異［7-8］。為了評(píng)價(jià)試劑盒Panel 靶向測(cè)序與WES 檢測(cè)一致性，中國(guó)食品藥品檢定研究院建立了腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)（TMB）國(guó)家參考品，其中用于TMB 檢測(cè)的參考品可以作為檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，用于評(píng)價(jià)腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)試劑盒的TMB 檢測(cè)一致性。

1 材料與方法

1.1 樣本

腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)國(guó)家參考品，由中國(guó)食品藥品檢定研究院（簡(jiǎn)稱中檢院）提供。

1.2 試劑與儀器

核酸純化試劑和TMB 檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法），購(gòu)自南京世和醫(yī)療器械有限公司；KAPA Library Quant Kit（illumina）Universal qPCR Mix，購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems 公司；測(cè)序試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Illumina 公司。超聲破碎儀，比利時(shí)Diagenode 公司；Qubit?4.0 熒光定量?jī)x，美國(guó)Life Technology 公司；Nextseq 550 DX 測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司。

1.3 TMB 檢測(cè)的國(guó)家參考品panel-TMB 檢測(cè)

11 對(duì)細(xì)胞系是腫瘤患者的腫瘤組織永生化細(xì)胞系（TMB-H）和配對(duì)白細(xì)胞永生化細(xì)胞系（TMBBL）。取每一對(duì)細(xì)胞系，使腫瘤細(xì)胞（TMB-H）基因組DNA 所占的體積比例分別為0%，1%，2%，5%和10%，其配對(duì)白細(xì)胞（TMB-BL）基因組DNA 所占的體積比例分別為100%，99%，98%，95%和90%，最終配制為每對(duì)細(xì)胞的5 個(gè)樣本（TMB-n-0%、TMBn-1%、TMB-n-2%、TMB-n-5%和TMB-n-10%）。取國(guó)家參考品基因組DNA，包括：DNA 經(jīng)超聲打斷，末端補(bǔ)平修復(fù)，3′ 末端腺苷化，兩端加上文庫(kù)接頭，文庫(kù)性擴(kuò)增后與外顯子芯片進(jìn)行捕獲富集，洗脫掉未富集的片段后進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)控合格后上機(jī)測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)使用Nextseq 550 Dx。使用試劑盒分析軟件的腫瘤突變負(fù)荷分析模塊分析樣本的TMB 結(jié)果。

1.4 試劑盒TMB 檢測(cè)一致性評(píng)價(jià)

根據(jù)TMB 國(guó)家參考品使用說明書提供的附件（1-filterMc3.py）對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行樣本及突變過濾。按照說明書附件提供的命令生成IDT 擴(kuò)展50堿基（base pair，bp）與編碼序列（Coding DNA Sequence，CDS）擴(kuò)展2bp 的交集bed（Browser Extensible Data）文件。使用說明書附件（2-restrainRegions.sh）提取癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）WES 區(qū)域的突變。使用說明書附件（3-calculateWesTmb.py）計(jì)算TCGA 樣本W(wǎng)ES 的TMB 值。使用說明書附件代碼（2-restrain-Regions.sh），提取TCGA Panel 區(qū)域的突變。過濾Panel 中的剪接突變（splice mutation）和驅(qū)動(dòng)突變（driver mutation）。計(jì)算TCGA 樣本Panel 的TMB值，合并TCGA 樣本W(wǎng)ES 和Panel 的TMB 值。使用說明書附件（5-createLinearRegModel.R）建立TCGA數(shù)據(jù)WES 和Panel TMB 的線性回歸方程，并得到90%置信區(qū)間和預(yù)測(cè)區(qū)間的文件。使用該模型對(duì)國(guó)家參考品在試劑盒的Panel TMB 結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 TMB 檢測(cè)國(guó)家參考品的Panel-TMB 值

統(tǒng)計(jì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)腫瘤基因的突變，去除種系突變，保留外顯子區(qū)域的突變，并去除驅(qū)動(dòng)突變，TMB 檢測(cè)國(guó)家參考品的Panel-TMB 值。見表1。

2.2 試劑盒TMB 檢測(cè)一致性評(píng)價(jià)結(jié)果

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)MC3 數(shù)據(jù)集的樣本總數(shù)為10295 個(gè)，每個(gè)樣本均有WES 檢測(cè)數(shù)據(jù)。經(jīng)過對(duì)上述樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，剔除質(zhì)控不合格數(shù)據(jù)，剩余可用于分析WES TMB 的樣本數(shù)據(jù)為6701 個(gè)，覆蓋24 個(gè)癌種。建立TCGA WES TMB 和Panel TMB的線性回歸方程是：WES=-1.3719+0.7214*Panel，Pearson 相關(guān)系數(shù)為0.99，Spearman 相關(guān)系數(shù)為0.80，見圖1。結(jié)果表明用于TMB 檢測(cè)的國(guó)家參考品中22 個(gè)TMB-5%和TMB-10%參考品，其標(biāo)準(zhǔn)TMB 值落在試劑盒檢測(cè)計(jì)算的WES-TMB 理論值90%預(yù)測(cè)區(qū)間的比例為90.9%（20/22），滿足TMB檢測(cè)國(guó)家參考品的要求：不低于90%，見圖2。對(duì)細(xì)胞比例為1%和2%的國(guó)家參考品樣本的標(biāo)準(zhǔn)TMB值僅供參考，不納入上述的計(jì)算。

表1 TMB 檢測(cè)國(guó)家參考品結(jié)果Table 1 The result of national reference materials for TMB detection

圖1 所有癌種WES 和Panel TMB 線性回歸圖Figure 1 Linear regression of WES and Panel TMB for all cancer types

圖2 試劑盒TMB 檢測(cè)一致性評(píng)價(jià)結(jié)果Figure 2 Consistency evaluation results of Panel TMB detection

3 討論

2017年，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的首個(gè)商業(yè)檢測(cè)TMB 的基因檢測(cè)Panel：FoundationOne CDx（F1CDx），覆蓋了324 個(gè)基因以及兩個(gè)預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）和TMB［9］。2019年FDA 批準(zhǔn)美國(guó)首個(gè)針對(duì)TMB 的癌癥全外顯子測(cè)序體外診斷產(chǎn)品-NantHealth 公司Omics Core，可檢測(cè)癌癥組織中的總體腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和468 個(gè)癌癥相關(guān)基因的體細(xì)胞突變［10］。而我國(guó)已經(jīng)有多個(gè)公司開展了腫瘤突變負(fù)荷（TMB）的診斷試劑產(chǎn)品的研發(fā)。但是目前TMB 檢測(cè)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，亟需開展腫瘤突變負(fù)荷（TMB）標(biāo)準(zhǔn)化研究，對(duì)不同診斷試劑研發(fā)企業(yè)的Panel-TMB 差異進(jìn)行評(píng)估。

為建立TMB 檢測(cè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，中檢院建立相應(yīng)的國(guó)家參考品，制定了WES 計(jì)算TMB 指標(biāo)的規(guī)則，即以編碼區(qū)±2 bp 的區(qū)間內(nèi)的非同義單核苷酸突變或插入缺失突變作為WES 捕獲測(cè)序樣本的TMB 指標(biāo)的計(jì)數(shù)基礎(chǔ)，不區(qū)分是否驅(qū)動(dòng)基因突變，可以是splice 功能突變。試劑盒可以將突變變異最大體細(xì)胞等位基因頻率（MSAF）≥1% 的突變計(jì)算的TMB 指標(biāo)為參考指標(biāo)；但是為了匹配不同的突變過濾策略，中檢院同時(shí)給出MSAF≥2%、3%、4%及5% 要求下的標(biāo)準(zhǔn)TMB。中檢院建立了Panel 的TMB 回報(bào)結(jié)果的規(guī)則。Panel 的TMB 指標(biāo)都可以與WES 的TMB 指標(biāo)形成線性回歸關(guān)系。研究報(bào)導(dǎo)，使用小Panel 捕獲測(cè)序，匹配針對(duì)性優(yōu)化的TMB 算法，可以達(dá)到與WES 中TMB 指標(biāo)的較強(qiáng)相關(guān)性。學(xué)者J.Budczies 從理論模擬和實(shí)際數(shù)據(jù)驗(yàn)證推知了Panel 大小，TMB 檢出數(shù)值對(duì)Panel 的TMB 檢出相對(duì)WES 的TMB 指標(biāo)的CV變化趨勢(shì)，CV 變化趨勢(shì)分別與Panel 大小和TMB值的平方根成反比［11］。從標(biāo)準(zhǔn)化TMB 檢測(cè)的角度，中檢院建議試劑盒Panel 檢測(cè)提供的TMB 指標(biāo)進(jìn)行自適應(yīng)的轉(zhuǎn)化來給出與WES 的標(biāo)準(zhǔn)TMB 指標(biāo)適配的檢測(cè)結(jié)果。國(guó)家參考品的結(jié)果包含兩部分內(nèi)容：樣本的標(biāo)準(zhǔn)TMB 值（WES 的TMB 值）和 按照Panel自身參數(shù)估計(jì)的該數(shù)值的90%置信區(qū)間。

TCGA 是美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）和美國(guó)人類基因組研究所（NHGRI）共同開發(fā)的大型腫瘤研究項(xiàng)目，旨在通過應(yīng)用高通量和多組學(xué)的腫瘤基因組分析技術(shù)，加深人類對(duì)腫瘤的認(rèn)知，從而提高腫瘤的預(yù)防、診斷和治療。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)包括轉(zhuǎn)錄組（RNA Seq 或表達(dá)譜芯片）、基因組（外顯子或全基因組測(cè)序）、表觀遺傳（甲基化芯片）和蛋白組等多組學(xué)數(shù)據(jù)［12］。目前TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)包含33 類癌種，約10 000 例tumor-normal 成對(duì)的外顯子數(shù)據(jù)［13］。TCGA 提供了大量腫瘤樣本W(wǎng)ES 數(shù)據(jù)，可用于探索驗(yàn)證panel 捕獲區(qū)域與WES 全外顯子捕獲區(qū)域TMB 值的線性一致性。通過TCGA 建模預(yù)測(cè)過程，建立TCGA 數(shù)據(jù)WES 和Panel TMB 的線性回歸方程，然后按照Panel 自身參數(shù)估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)TMB 值（WES 的TMB 值）的90%預(yù)測(cè)區(qū)間，然后計(jì)算樣本的標(biāo)準(zhǔn)TMB 值落在試劑盒檢測(cè)計(jì)算的WES-TMB 理論值90%預(yù)測(cè)區(qū)間的比例，用于評(píng)價(jià)panel 的TMB 檢測(cè)一致性。

本研究采用Panel 的檢測(cè)方法，對(duì)國(guó)家參考品中TMB 檢測(cè)參考品進(jìn)行了TMB 的檢測(cè)，用于試劑盒（Panel）的TMB 檢測(cè)一致性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明TMB-5%和TMB-10%參考品的標(biāo)準(zhǔn)TMB 值落在試劑盒檢測(cè)計(jì)算的WES-TMB 理論值90%預(yù)測(cè)區(qū)間的比例為90.9%，滿足了TMB 檢測(cè)國(guó)家參考品的要求：即比例應(yīng)不低于90%。研制的TMB 國(guó)家參考品，能夠滿足腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)試劑盒的TMB 檢測(cè)一致性評(píng)價(jià)的要求，為TMB 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化研究提供可靠的工具，具有重要的意義。